可生物點擊的小細(xì)胞外囊泡-缺血性中風(fēng)的COCKTAIL療法

        通過血腦屏障遞送大分子治療缺血性卒中仍然具有挑戰(zhàn)性。NR2B9c是一種有效的神經(jīng)保護肽，但將它靶向遞送至大腦需要一種高效、天然和非免疫原性的安全遞送技術(shù)。小細(xì)胞外囊泡（sEV）作為一種非免疫原性的天然貨物輸送系統(tǒng)已顯示出巨大的潛力。然而，需要對其低效的大腦靶向進行定制。在這里，作者通過生物正交點擊化學(xué)反應(yīng)將狂犬病病毒糖蛋白29與sEVs表面偶聯(lián)，然后加載NR2B9c，最終產(chǎn)生中風(fēng)特異性治療性COCKTAIL（sEVs-COCKTAIL）。體外培養(yǎng)原代神經(jīng)元和Neuro-2a細(xì)胞，并使用瞬時大腦中動脈閉塞模型進行體內(nèi)研究，以評估sEVs-COCKTAIL的神經(jīng)元靶向性和抗缺血性卒中潛力。生物可點擊的sEVs被神經(jīng)元選擇性地吸收，而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞則不吸收。在氧-葡萄糖剝奪的體外缺血性腦卒中模型中，sEVs-COCKTAIL對活性氧和細(xì)胞凋亡表現(xiàn)出顯著的潛力。體內(nèi)研究進一步證明了可生物點擊的sEV的具有大腦靶向性并且半衰期延長，將NR2B9c輸送到缺血性腦并減少中風(fēng)損傷。用sEVs-COCKTAIL治療顯著促進小鼠行為恢復(fù)并減少了短暫性大腦中動脈閉塞后的神經(jīng)元凋亡。NR2B9c被遞送至與突觸后密度蛋白95結(jié)合的神經(jīng)元，抑制N-甲基-d-天冬氨酸受體介導(dǎo)的氧化應(yīng)激過度產(chǎn)生，并減輕蛋白B細(xì)胞淋巴瘤2和P38蛋白的表達。該研究制備的sEVs-COCKTAIL可促進神經(jīng)恢復(fù)和神經(jīng)保護，防止缺血性中風(fēng)，為靶向遞送系統(tǒng)提供了一種有效的方法，是一種很有前途的中風(fēng)治療方式。該研究于2023年9月發(fā)表于《Journal of Controlled Release》，íF = 10.8。

技術(shù)路線

研究思路

1.sEV和sEVs-COCKTAIL的制備和表征

        采用高效液相色譜法和質(zhì)譜法對NR2B9c和Azido-RVG29進行了表征，以確定其各自的純度和分子量（附圖1-2）。為了開發(fā)sEVs-COCKTAIL，作者選擇首先將RVG29病毒蛋白偶聯(lián)到sEV上，然后用NR2B9c加載它，基于在點擊偶聯(lián)過程中將NR2B9c預(yù)加載到sEVs核心可能導(dǎo)致加載的藥物從sEV中意外釋放。RVG29到sEV的偶聯(lián)分兩步實現(xiàn)（圖1A）。N-羥基琥珀酰亞胺-PEG的N-羥基琥珀酰亞胺基團4-DBCO與賴氨酸的sEV表面胺基反應(yīng)，形成DBCO-sEVs。然后，通過將DBCO-sEVs與Azido-RVG29反應(yīng)進行簡單的點擊反應(yīng)。通過熒光顯微鏡驗證了RVG29與sEV結(jié)合的成功，作者用FITC標(biāo)記RVG29，用Dil-Red標(biāo)記sEV。如圖1B所示，RVG29和sEV的熒光信號重疊，證實了它們的偶聯(lián)過程成功。在整個研究過程中都遵循這種綜合方法。

        接下來，使用超聲技術(shù)將神經(jīng)保護肽NR2B9c加載RVG-sEV，這是高產(chǎn)量裝載sEV的常見做法。評估了兩種上樣方案，通過簡單的超聲處理獲得了最高的上樣結(jié)果。通過分光光度計測得兩種肽的封裝效率分別為29.903±3.32%和18.689±1.64%（圖1C）。通過TEM、NTA、蛋白質(zhì)印跡和zeta電位分析儀對sEV進行物理表征。透射電鏡證實了所有sEV的球形形貌和完整的膜結(jié)構(gòu)（圖1D），表明脂質(zhì)雙層被保留，包封肽的過程不影響sEV的完整性。由于NTA分析，sEV的平均尺寸為98.6±17 nm，RVG-sEVs為102.6±16.37 nm，sEVs-COCKTAIL為125±15.4 nm（圖1E ）。其次，通過蛋白質(zhì)印跡法顯示sEV蛋白表達了常用的sEV蛋白標(biāo)記物CD63和TSG101（圖1F）。sEV（-16.7±0.72 mV）、RVG-sEVs（-11.0±1.10 mV）和sEVs-COCKTAIL（-10.8±1.27 mV）的zeta電位為負(fù)值（圖1G）。RVG29是一種帶正電荷的肽，其偶聯(lián)增加了zeta電位，而NR2B9c負(fù)載的sEV尺寸增加，表明sEV的標(biāo)記和負(fù)載成功。體外研究sEV和sEVs-COCKTAIL的NR2B9c釋放曲線顯示出在前4小時內(nèi)爆發(fā)釋放并且在后續(xù)的時間里持續(xù)釋放（圖1H）。sEVs-COCKTAIL在含或不含10% FBS的PBS中穩(wěn)定至少一周（圖1I）。

圖1.sEVs-COCKTAIL的制備和表征

2.sEVs-COCKTAIL的細(xì)胞攝取和體外抗缺血卒中效率

        首先，作者通過將sEV制劑（NR2B9cConc，25、50、100、200 nM）與原代神經(jīng)元孵育來確認(rèn)體外細(xì)胞相容性。6小時后，CCK-8測定結(jié)果顯示sEV對神經(jīng)元活力沒有不利影響（圖2A）。作者選擇負(fù)載NR2B9c的濃度為50 nM的sEV-COCKTAIL進行體外研究。

        作者通過開發(fā)體外缺血性腦卒中OGD模型研究了sEVs-COCKTAIL對Neuro-2a細(xì)胞的體外抗缺血性卒中作用。首先，通過酶標(biāo)儀評估sEV制劑的保護潛力。結(jié)果顯示，OGD使細(xì)胞活力降低至61.42%，在sEVs-COCKTAIL處理組存在下顯著增加（92.057%）（圖2B）。重要的是，OGD誘導(dǎo)的損傷在僅NR2B9c存在的情況下恢復(fù)率為78.420%。

        ROS在卒中嚴(yán)重程度中起著核心作用，因此抑制ROS產(chǎn)生炎癥通路是抑制卒中治療過程中組織死亡的基礎(chǔ)。采用DCFH-DAROS檢測試劑盒進行細(xì)胞間ROS檢測。如圖2C所示，與對照組相比，OGD處理的ROS水平提高到304.693%。sEVs-COCKTAIL處理顯示出ROS水平的顯著降低，減輕了ROS的過量產(chǎn)生并保護細(xì)胞免受ROS降解。在僅NR2B9c存在下，ROS水平升高了109.85%，而sEVs-NR2B9c和sEVs-COCKTAIL分別降低了121.745%和149.87%。

        sEV細(xì)胞內(nèi)化首先在Neuro-2a細(xì)胞中研究。與Neuro-2a細(xì)胞孵育sEV4小時后，通過共聚焦顯微鏡分析可以看到細(xì)胞攝取的明顯增加（圖2D-E），表明與sEV相比，RVG29偶聯(lián)增加了sEV的細(xì)胞攝取特性。RVG29靶向Neuro-2a細(xì)胞上表達的nAChR受體，sEV可通過受體介導(dǎo)的通路被Neuro-2a細(xì)胞有效攝取。

        RVG29是獨有的附著在神經(jīng)元上大量存在的N-乙酰膽堿受體的狂犬病病毒蛋白。因此，為了確認(rèn)RVG-sEVs的神經(jīng)元靶向潛力，作者培養(yǎng)了原代神經(jīng)元，并將它們與sEV制備的組一起孵育。共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，與sEVs相比，RVG-sEVs被神經(jīng)元更有效地吸收（圖2F）。sEV熒光強度的定量分析表明，RVG-sEV神經(jīng)元靶向比sEV高26.42%，比小膠質(zhì)細(xì)胞高43.69%，比星形膠質(zhì)細(xì)胞高47.8%（圖2G）。這些結(jié)果表明，點擊化學(xué)技術(shù)有效地將RVG29與sEVs表面偶聯(lián)，從而有效地靶向sEV神經(jīng)元。

圖2.sEVs-COCKTAIL的體外細(xì)胞相容性和細(xì)胞攝取

3.tMCAO小鼠模型的大腦靶向研究

        為了評估sEV制劑的體內(nèi)和離體循環(huán)行為以及大腦靶向能力，作者使用了tMCAO小鼠模型。使用活體成像系統(tǒng)（IVIS）靜脈注射近紅外熒光染料、DiR標(biāo)記的游離sEV、RVG-sEV和游離DiR，以跟蹤tMCAO小鼠體內(nèi)和離體的sEV。體內(nèi)研究結(jié)果顯示，sEV信號主要存在于tMCAO小鼠的腹部和大腦中，并隨著時間的推移而減少（圖3A）。為了確定RVG29修飾是否增加了大腦中sEV的半衰期，作者檢查了24小時、48小時和72小時的熒光信號。有趣的是，RVG-sEVs在缺血性腦中24小時、48小時和72小時的輻射平均效率顯著提高（圖3C），這表明RVG29修飾不僅增加了sEVs的大腦靶向性，而且增加了其半衰期。作者注意到RVG-sEVs的熒光隨著時間的流逝在大腦中增加，而在48小時內(nèi)沒有減少，這與EVs相反。這些發(fā)現(xiàn)表明，RVG-sEVs可以在受傷的大腦中停留更長時間，并且可以有效地釋放藥物。在24小時內(nèi)在小鼠中觀察到較低量的游離DiR，主要存在于小鼠的肝臟和脾臟中，并在給藥后48小時內(nèi)從體內(nèi)完全清除。

        對于sEVs的器官分布，處死小鼠，收集主要器官（肺、心臟、脾臟、腎臟、腦、肝和腸）進行離體成像（圖3B）。結(jié)果表明，在肝臟、脾臟和肺中檢測到更多的sEV制劑。在胃腸道、腎臟和心臟中觀察到最小的sEV分布（圖3D）。在大腦中，48小時時，與未注射的sEV相比，RVG-Sev處理小鼠觀察到的熒光信號強2.05倍（圖3E）。大量RVG-sEV存在長達48小時，并從體內(nèi)逐漸清除。

        為了進一步確認(rèn)RVG-sEVs的神經(jīng)元靶向能力，將PKH-26標(biāo)記的sEVs制劑靜脈注射到中風(fēng)小鼠體內(nèi)，并評估其熒光強度。與sEVs相比，RVG-sEVs組觀察到更高的熒光信號（圖3F）。此外，與大腦的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞相比，RVG29偶聯(lián)的sEV主要被神經(jīng)元吸收的量更高（圖3G-H）。

        這些發(fā)現(xiàn)證實了RVG-sEVs在靶向神經(jīng)元和大腦方面的潛力。RVG29的常見靶向受體是nAchRs，主要存在于大腦的神經(jīng)元和內(nèi)皮細(xì)胞上。研究人員已經(jīng)證實，RVG29靶向主要對神經(jīng)元具有特異性，不靶向其他神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。相比之下，其他BBB和大腦靶向肽，如T7肽、血管肽2肽和細(xì)胞穿透肽，如TAT、SynB、Penetratin、聚精氨酸、轉(zhuǎn)運蛋白10，共同的靶點不是神經(jīng)元。例如，T7肽常見的靶向受體是轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，存在于腦內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元、上皮細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞上。它在肝細(xì)胞和紅細(xì)胞上也高度表達，使其對大腦不具有特異性，尤其是對神經(jīng)元而言并非獨有。惡性細(xì)胞表達轉(zhuǎn)鐵蛋白受體水平升高，這就是T7肽主要被研究用于結(jié)直腸癌、肺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等癌癥靶向的原因。Angiopep2靶向存在于肝、腎、膀胱和肺等多種組織中的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白2（LPR），并擴散到整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)（神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞、惡性星形細(xì)胞瘤、內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞）。LRP1在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞上大量表達，并利用血管pep2。研究人員已經(jīng)開發(fā)了LRP1靶向能力和angiopep2工程化的sEV、納米顆粒和納米囊泡，用于靶向膠質(zhì)母細(xì)胞瘤。同樣，細(xì)胞穿透肽的靶向性也不具有特異性，可以穿透活生物體內(nèi)的各種類型的細(xì)胞，從而產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。

圖3.sEV制劑的體內(nèi)生物分布研究

4.小鼠tMCAO模型中的sEVs-COCKTAIL抗缺血性卒中電位

        采用tMCAO小鼠模型評價sEVs-COCKTAIL的體內(nèi)抗缺血性腦卒中和神經(jīng)保護效率。tMCAO模型具有高度可重復(fù)性，非常適合評估神經(jīng)保護分子的有效。將小鼠隨機分為5組，檢測局部腦血流量（圖4B）。tMCAO手術(shù)組的腦血流量減少和恢復(fù)相當(dāng)（圖4C）。72小時后評估紅外體積，tMCAO90分鐘后每天評估m(xù)NSS。如圖4D所示，假手術(shù)小鼠未發(fā)現(xiàn)梗死，PBS小鼠組明顯增加。重要的是，與其他治療組相比，sEVs-COCKTAIL治療顯著減少了梗死體積（圖4E）。為了更好地了解治療對功能和神經(jīng)恢復(fù)的影響，進行了行為測試。與其他治療組相比，sEVs-COCKTAIL治療組在神經(jīng)功能缺損的恢復(fù)方面的mNSS顯著增加（圖4F）。從EBST中也獲得了類似的結(jié)果，與其他組小鼠相比，用sEVs-COCKTAIL治療的小鼠具有更好的平衡能力（圖4G）。在體重減輕的恢復(fù)中顯示了相同的治療效果（圖4H）?？傮w而言，這些結(jié)果表明，與其他組相比，sEVs-COCKTAIL治療提供了更高的梗死體積和神經(jīng)功能缺損恢復(fù)效果。

        為了確認(rèn)觀察到的治療效果歸因于NR2B9c向缺血性腦的遞送，在24小時后通過IVIS成像系統(tǒng)在tMCAO小鼠中檢測DiR標(biāo)記的靜脈注射sEVs制劑。與sEV相比，sEVs-COCKTAIL和RVG-sEVs組的熒光信號明顯更強（圖4I-J），表明RVG-sEVs已成功將NR2B9c遞送至缺血性腦。與TAT相似，靶向RVG29可直接與NR2B9c偶聯(lián)，但RVG（29個AAs）的氨基酸（AA）長度比TAT（11個AAs）長。因此，直接偶聯(lián)可能會影響NR2B9c的功能特性，影響其介導(dǎo)PDZ與PSD-95結(jié)合的能力。此外，與RVG直接偶聯(lián)NR2B9c相比，RVG-sEV提供了更長的NR2B9c暴露時間。此外，還研究了sEV在提高貨物穩(wěn)定性、吸收、控釋和靶向遞送方面的應(yīng)用。相比之下，與NR2B9c偶聯(lián)的RVG29肽可能會觸發(fā)免疫反應(yīng)并被巨噬細(xì)胞系統(tǒng)清除出體外，從而降低到達靶位點的機會，導(dǎo)致穩(wěn)定性差和半衰期短。

        為了進一步驗證NR2B9c是否從sEVs-COCKTAIL中釋放并與PSD-95偶聯(lián)，作者檢測了PSD-59與NR2B9c在中風(fēng)小鼠中的共定位。免疫共熒光染色結(jié)果顯示PSD-95與NR2B9c偶聯(lián)（圖4K）。這些發(fā)現(xiàn)證明治療效果是由于sEVs-COCKTAIL釋放NR2B9c，而sEVs-COCKTAIL又與PSD-95結(jié)合并破壞NMDAR受體與PSD-95的相互作用，導(dǎo)致一氧化氮的產(chǎn)生減少。相比之下，在缺血核心的對側(cè)未觀察到PSD-95與NR2B9c的共定位，代表NR2B9c對缺血核心的靶向。這些結(jié)果表明，RVG-sEVs成功地將NR2B9c遞送至缺血小鼠的大腦，發(fā)揮了治療作用。先前的研究表明，NR2B9c需要以較高劑量（10 nM/g）給藥，而較低劑量對小鼠無效。作者的研究結(jié)果表明，當(dāng)通過RVG-sEV遞送時，較低劑量的5 nM/g NR2B9c可產(chǎn)生顯著的治療效果。最近的臨床試驗TAT-NR2B9c在一些患者中表現(xiàn)出治療效果。然而，TAT-NR2B9c和tPA的聯(lián)合給藥并沒有提高治療效率。聯(lián)合給藥缺乏改善的結(jié)果很可能是因為高正電荷的TAT介導(dǎo)NR2B9c和tPA的非特異性結(jié)合，導(dǎo)致NR2B9c活性喪失。鑒于sEVs是一種出色的生物相容性納米載體，并具有固有的神經(jīng)保護作用。作者相信，如果使用RVG-sEVs，NR2B9c和tPA的組合而不是TAT，NR2B9c和tPA進行，該臨床試驗可以在缺血性腦卒中治療中取得更大的成功。

圖4.tMCAO小鼠模型中sEVs-COCKTAIL的抗缺血性卒中潛力

5.sEVs-COCKTAIL療法通過介導(dǎo)NMDAR下游信號蛋白和預(yù)防細(xì)胞凋亡的神經(jīng)保護潛力

        缺血性損傷影響NMDAR受體的細(xì)胞質(zhì)尾部，NMDAR受體被認(rèn)為是信號蛋白的主要樞紐。針對NR2B9c發(fā)揮神經(jīng)保護作用的分子機制，研究了tMCAO后NMDAR細(xì)胞質(zhì)尾下游神經(jīng)元存活信號蛋白Bcl-2和死亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)P38蛋白表達。在腦海馬CA1區(qū)tMCAO24h和72h后測量Bcl-2和p38的表達。Bcl-2表達在卒中24h時顯著降低，在卒中72h時保持低水平。sEVs-COCKTAIL療法相對調(diào)節(jié)Bcl-2的表達（圖5A）。同樣，P38表達受到缺血性損傷的影響，缺血性損傷在卒中后24h在PBS或其他治療組中上調(diào)，并且在sEVs-COCKTAIL治療后顯著下調(diào)。在72小時時間點，p38的蛋白表達水平發(fā)生了相對變化，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖5B）?；谶@一發(fā)現(xiàn)，p38可能不是導(dǎo)致NMDAR下游神經(jīng)元死亡的獨有信號通路。

        為了進一步評估sEVs-COCKTAIL的神經(jīng)保護作用，作者進行了TUNEL測定以評估缺血性損傷后神經(jīng)元的凋亡。免疫熒光染色結(jié)果顯示tMCAO治療3天后出現(xiàn)TUNELNeuN神經(jīng)元。在治療組中，PBS和其他治療組的TUNEL細(xì)胞密度較高。sEVs-COCKTAIL的TUNEL神經(jīng)元數(shù)量相對顯著減少（圖5I-J）。綜上所述，這些結(jié)果表明sEVs-COCKTAIL通過調(diào)節(jié)Bcl-2和P38的表達并抑制缺血性腦卒中后的細(xì)胞凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

圖5.sEVs-COCKTAIL療法介導(dǎo)NMDAR下游蛋白并在tMCAO后保護神經(jīng)元

3.6.體內(nèi)生物安全性評價

        為了進行安全性檢測，作者通過尾靜脈向健康小鼠注射sEVs-COCKTAIL或PBS 7天。最后一次給藥后，對小鼠組織（腦、心臟、肺、肝、腎和脾臟）樣本進行全血細(xì)胞計數(shù)、血清生化分析和HE染色，以監(jiān)測潛在的毒性。在組織切片中未發(fā)現(xiàn)異?；蜓装Y細(xì)胞（圖6A）。血清生化試驗顯示，小鼠組每日給藥1周后無明顯異常（圖6B-C）。這些結(jié)果證實了sEVs-COCKTAIL在體內(nèi)表現(xiàn)出優(yōu)異的生物相容性。

圖6. 體內(nèi)生物安全性評價

結(jié)語

        在這項研究中，作者開發(fā)了基于sEVs的腦靶向藥物輸送系統(tǒng)，用于缺血性中風(fēng)的治療。作者將神經(jīng)保護肽（NR2B9c）遞送至大腦，克服血腦屏障，靶向神經(jīng)元，增加生物分布和生物利用度。

        作者通過點擊反應(yīng)用神經(jīng)元靶向肽RVG29設(shè)計了sEV，它們將NR2B9c以更高的效率特異性遞送至缺血神經(jīng)元，以防止腦缺血期間過度產(chǎn)生ROS，在神經(jīng)元靶向和NR2B9c遞送方面取得了令人滿意的結(jié)果。當(dāng)將sEVs-COCKTAIL靜脈注射給中風(fēng)小鼠時，神經(jīng)功能缺損、梗死大小和神經(jīng)元凋亡顯著恢復(fù)。從機制上講，sEVs-COCKTAIL的神經(jīng)保護作用部分是由于Bcl-2和p38蛋白表達水平的調(diào)節(jié)。靜脈注射sEVs-COCKTAIL7天后，小鼠主要器官和大腦未產(chǎn)生不良反應(yīng)。

        由于sEVs-COCKTAIL具有抗ROS、神經(jīng)元靶向和神經(jīng)保護特性，未來的研究可能會探索其對其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療效率，如出血性腦卒中、創(chuàng)傷性腦損傷和阿爾茨海默病。綜上所述，設(shè)想這種基于點擊化學(xué)的RVG29修飾的載NR2B9c的sEV，是將sEV與NR2B9c一起用于缺血性卒中治療臨床成功的最佳方法。

參考文獻

        Haroon K, Ruan H, Zheng H, Wu S, Liu Z, Shi X, Tang Y, Yang GY, Zhang Z. Bio-clickable, small extracellular vesicles-COCKTAIL therapy for ischemic stroke. J Control Release. 2023 Nov;363:585-596. doi: 10.1016/j.jconrel.2023.10.003. Epub 2023 Oct 11. PMID: 37793483.

實驗方法

        藥物釋放曲線、細(xì)胞培養(yǎng)、ROS檢測、細(xì)胞活死染色、CCK-8實驗、細(xì)胞攝取實驗、動物建模、行為學(xué)分析、WB、免疫熒光染色、HE染色