NSUN2介導(dǎo)SLC7A11 mRNA的m5C修飾賦予子宮內(nèi)膜癌鐵死亡抗性

       子宮內(nèi)膜癌（EC）是世界范圍內(nèi)普遍存在的婦科惡性腫瘤，mRNA的5-甲基胞嘧啶（m5C）修飾是一種重要的表觀遺傳學(xué)修飾，與多種癌癥的發(fā)展發(fā)生有關(guān)。然而，m5C修飾在EC中的確切功能仍然難以捉摸。本研究旨在研究主要m5C修飾因子NSUN2在EC中的表達(dá)和臨床意義。作者的研究結(jié)果表明，KDM5A下調(diào)觸發(fā)H3K4me3在啟動子區(qū)的表觀遺傳增加，從而導(dǎo)致NSUN2在EC中顯著上調(diào)。此外，功能獲得和喪失實(shí)驗(yàn)揭示NSUN2增強(qiáng)了mRNA的 m5C修飾作用，從而促進(jìn)EC細(xì)胞增殖。采用RNA亞硫酸氫鹽測序和轉(zhuǎn)錄組測序來闡明NSUN2在鐵死亡中的作用。隨后的體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，敲低NSUN2顯著上調(diào)EC細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化物和脂質(zhì)ROS的水平，從而增強(qiáng)EC對鐵死亡的易感性。從機(jī)制上講，NSUN2促進(jìn)SLC7A11 mRNA的m5C修飾，m5C閱讀器YBX1通過其內(nèi)部冷休克結(jié)構(gòu)域（CSD）直接識別并結(jié)合SLC7A11 mRNA上的m5C位點(diǎn)，導(dǎo)致SLC7A11 mRNA穩(wěn)定性增加和SLC7A11水平升高。此外，挽救實(shí)驗(yàn)表明，NSUN2對依賴SLC7A11的鐵死亡具有抑制作用?？傊?，靶向NSUN2/SLC7A11軸通過增加體外體內(nèi)EC細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化和鐵死亡來抑制腫瘤生長。該研究為NSUN2的作用提供了新的見解，表明NSUN2可能是EC患者的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。該研究于2023年11月發(fā)表在《Redox Biology》，IF 11.4。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1 EC患者NSUN2表達(dá)升高與預(yù)后不良相關(guān)

       為研究m5C修飾在EC進(jìn)展中的潛在作用，作者初步分析了TCGA-UCEC數(shù)據(jù)集中關(guān)鍵m5C調(diào)控基因的表達(dá)。他們發(fā)現(xiàn)，催化mRNA m5C的NSUN2顯著上調(diào)（圖1A）。同時還在TCGA數(shù)據(jù)庫中比較了配對EC組織和相鄰正常組織中NSUN2的mRNA水平，結(jié)果表明NSUN2在EC中高表達(dá)（圖1B）。此外，根據(jù)CPTAC的公開數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)EC中NSUN2蛋白表達(dá)高于正常子宮內(nèi)膜組織（圖1C）。使用RT-qPCR和蛋白質(zhì)印跡來評估手術(shù)切除標(biāo)本中NSUN2的mRNA和蛋白質(zhì)水平，這證實(shí)了與正常組織相比，NSUN2在EC組織中過表達(dá)（圖1D和E）。免疫組織化學(xué)顯示，NSUN2在EC組織中高度表達(dá)，主要位于細(xì)胞核中（圖1F）。通過分析臨床病理因素評估NSUN2的預(yù)后意義，發(fā)現(xiàn)NSUN2在EC中的表達(dá)水平與FIGO分期、組織學(xué)分級和病理類型密切相關(guān)（圖1G–I）。此外，NSUN2高表達(dá)的患者顯示出更差的預(yù)后（圖1J）?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)表明NSUN2常在EC中上調(diào)，使其成為潛在的預(yù)后指標(biāo)。

圖1：NSUN2過表達(dá)預(yù)測子宮內(nèi)膜癌預(yù)后不良

2 H3K4me3的表觀遺傳改變誘導(dǎo)NSUN2上調(diào)

       組蛋白的翻譯后修飾（PTM）在癌細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。因此，使用WashU表觀基因組瀏覽器和Cistrome數(shù)據(jù)瀏覽器來探索NSUN2是否受表觀遺傳學(xué)機(jī)制的調(diào)節(jié)，該機(jī)制發(fā)現(xiàn)H3K4me3在NSUN2的啟動子區(qū)顯著富集（圖2A）。富含H3K4me3的基因啟動子通常與轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)，這表明升高的NSUN2可能受到組蛋白甲基化調(diào)節(jié)。此外，進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）測定進(jìn)一步測定EC細(xì)胞中的組蛋白甲基化水平，并且ChIP PCR結(jié)果表明組蛋白H3賴氨酸4（H3K4）三甲基化（H3K4me3）在NSUN2的啟動子區(qū)顯著富集（圖2B）。為更深入地了解潛在機(jī)制，作者分析了TCGA-UCEC數(shù)據(jù)集中H3K4me3的賴氨酸甲基化酶和去甲基化酶的表達(dá)。研究結(jié)果表明，KDM5A表達(dá)減少可能是導(dǎo)致NSUN2啟動子區(qū)H3K4me3水平升高的主要因素。然后使用siRNA技術(shù)敲低EC細(xì)胞中內(nèi)源性KDM5A的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NSUN2的mRNA水平顯著增加（圖2C）。此外，蛋白質(zhì)印跡結(jié)果還表明，敲低KDM5A導(dǎo)致NSUN2蛋白水平和H3K4me3水平增加，而過表達(dá)KDM5A產(chǎn)生相反的結(jié)果（圖2D）。一致地，在KDM5A過表達(dá)的EC細(xì)胞中進(jìn)行ChIP-PCR，結(jié)果表明KDM5A過表達(dá)導(dǎo)致NSUN2啟動子區(qū)中H3K4me3富集顯著降低（圖2E）。類似地，作者還在Cistrome數(shù)據(jù)瀏覽器中的NSUN2啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)KDM5A的富集，并且使用KDM5A抗體的ChIP PCR測定也證實(shí)KDM5A在EC中結(jié)合NSUN2的啟動子（圖2F和G）。此外，作者繼續(xù)在EC細(xì)胞系中抑制KDM5A，并進(jìn)CUT&Tag分析。研究結(jié)果表明，降低KDM5A水平可以增加H3K4me3在啟動子區(qū)的積累（圖2H）。此外，IGV圖譜顯示，在KDM5A敲低后，NSUN2啟動子區(qū)中H3K4me3富集信號增強(qiáng)（圖2I）。綜上所述，以上結(jié)果進(jìn)一步揭示了NSUN2的上調(diào)是由于KDM5A減少介導(dǎo)的H3K4me3增加而發(fā)生的。

圖2：NSUN2上調(diào)受H3K4me3表觀遺傳改變的調(diào)節(jié)

3 NSUN2在mRNA上沉積m5C并促進(jìn)EC體外增殖

       為進(jìn)一步證明NSUN2對體內(nèi)腫瘤進(jìn)展的調(diào)節(jié)作用，作者評估了NSUN2在不同EC細(xì)胞系和正常子宮內(nèi)膜（NE）中的mRNA和蛋白表達(dá)。與原代正常細(xì)胞相比，在癌癥細(xì)胞系中觀察到NSUN2水平增加（圖3A和B），并選擇HEC-1B、KLE和Ishikawa細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)研究。使用shRNA敲低使HEC-1B和KLE細(xì)胞中的NSUN2沉默，并使用NSUN2表達(dá)載體在Ishikawa細(xì)胞中過表達(dá)NSUN2。從所示載體轉(zhuǎn)染的三種EC細(xì)胞系中純化mRNA，并用識別m5C的抗體進(jìn)行點(diǎn)印跡分析，這表明NSUN2敲低導(dǎo)致m5C水平降低，而NSUN2過表達(dá)導(dǎo)致m5C mRNA水平增加（圖3C）。隨后，進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)來評估NSUN2對EC細(xì)胞增殖的影響，包括CCK-8、克隆形成和EDU測定。如圖3D–F所示，NSUN2敲低有效抑制了HEC-1B和KLE細(xì)胞的增殖，而NSUN2的過表達(dá)促進(jìn)Ishikawa細(xì)胞的增殖。

       作為主要的mRNA m5C甲基轉(zhuǎn)移酶，已證實(shí)NSUN2釋放（半胱氨酸271）和催化（半胱氨酸321）位點(diǎn)的突變完全消除了其對mRNA m5C水平的調(diào)節(jié)作用。因此，作者構(gòu)建了野生型和雙突變體NSUN2過表達(dá)質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染到具有穩(wěn)定敲低NSUN2的EC細(xì)胞中。與野生型NSUN2相比，突變體NSUN2未能恢復(fù)EC細(xì)胞的增殖能力?？傊@些結(jié)果表明NSUN2通過m5C修飾促進(jìn)體外EC增殖。

圖3：NSUN2參與m5C水平的調(diào)節(jié)和EC細(xì)胞的增殖能力

4 NSUN2刺激EC中m5C的高甲基化

       由于NSUN2是一種主要的mRNA甲基轉(zhuǎn)移酶，對來源于對照或sh-NSUN2載體轉(zhuǎn)染的HEC-1B細(xì)胞的mRNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽測序（BS-seq）（圖4A）。如圖4B所示，NSUN2敲低導(dǎo)致m5C修飾位點(diǎn)顯著減少。在使用WebLogo生成的可能序列背景中，觀察到m5C位點(diǎn)下游C[A/C]GGG的頻率更高（圖4C）。繪制了HEC-1B mRNA上m5C位點(diǎn)的分布密度圖，結(jié)果表明m5C位點(diǎn)位于編碼區(qū)（CDS）：5′UTR 和 3′UTR（圖4D）。不同甲基化區(qū)域（DMRs）是樣本之間甲基化水平存在顯著差異的區(qū)域，可能在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。使用Metylene軟件，鑒定了對照組和NSUN2敲低組之間的差異甲基化修飾基因。顯著DMR的臨界值為|甲基化變化|>0.1和p<0.05（圖4E）。在這些不同甲基化的基因中，有更多的基因在NSUN2敲低后甲基化水平降低了一個以上（圖4F）。使用KOBAS3.0對不同甲基化的基因進(jìn)行途徑富集分析，并觀察到氧化應(yīng)激反應(yīng)、鐵死亡和鐵攝取的顯著富集（圖4G）。

圖4：NSUN2介導(dǎo)的m5C修飾mRNA調(diào)控的鑒定

5 NSUN2下調(diào)使EC對鐵死亡易感

       考慮到差異甲基化基因在鐵死亡通路中富集，作者推測NSUN2可能參與EC鐵死亡的調(diào)節(jié)。鐵死亡的特征是由半胱氨酸缺失和大量脂質(zhì)過氧化誘導(dǎo)的鐵依賴性細(xì)胞死亡。在之前的研究中，作者發(fā)現(xiàn)EC細(xì)胞中存在顯著的鐵死亡抵抗，靶向鐵死亡是EC的潛在治療方法。在功能上，NSUN2敲低以濃度依賴的方式顯著促進(jìn)erastin誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡（圖5A和B）。值得注意的是，Fer-1是鐵死亡的抑制劑，在NSUN2敲低的情況下抑制了erastin誘導(dǎo)的HEC-1B和KLE細(xì)胞中細(xì)胞死亡的增加（圖5C和D）。這表明NSUN2參與EC細(xì)胞中鐵死亡的調(diào)節(jié)。類似地，用erastin或DMSO處理EC細(xì)胞12小時，并進(jìn)行活細(xì)胞或死細(xì)胞染色，這表明NSUN2敲低顯著增加了erastin誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡（圖5E）。此外，相對的細(xì)胞內(nèi)MDA濃度和脂質(zhì)ROS水平表明，NSUN2敲低導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和脂質(zhì)ROS的程度顯著增加（圖5F和G）。透射電子顯微鏡（TEM）分析進(jìn)一步顯示，NSUN2敲低的EC細(xì)胞表現(xiàn)出典型的鐵死亡形態(tài)學(xué)特征，包括線粒體萎縮和膜密度升高（圖5H）?？傊?，這些觀察結(jié)果支持NSUN2下調(diào)使EC對鐵死亡易感。

圖5：NSUN2敲低促進(jìn)EC鐵死亡

6 NSUN2介導(dǎo)的SLC7A11 mRNA m5C修飾維持其穩(wěn)定性

       為探索NSUN2調(diào)節(jié)鐵死亡的分子機(jī)制，作者分析了RNA亞硫酸氫鹽和轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，并鑒定了一系列RNA甲基化水平改變的鐵死亡相關(guān)基因（圖6A）。SLC7A11是HEC-1B細(xì)胞中NSUN2敲低后最顯著下調(diào)的基因（圖6B）。KLE細(xì)胞系中SLC7A11 mRNA水平在NSUN2敲低后顯示出顯著的降低（圖6C）。此外，在HEC-1B和KLE細(xì)胞中，NSUN2敲低降低了SLC7A11蛋白水平。相反，Ishikawa細(xì)胞中NSUN2過表達(dá)顯著增加SLC7A11蛋白水平（圖6D）。為了研究NSUN2對SLC7A11的m5C修飾的潛在調(diào)節(jié)作用，作者使用野生型或雙突變體NSUN2在Ishikawa細(xì)胞中進(jìn)行過表達(dá)實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果表明，與野生型NSUN2相比，突變體NSUN2不能誘導(dǎo)SLC7A11蛋白水平的上調(diào)（圖6E），表明SLC7A11的表達(dá)依賴于NSUN2調(diào)節(jié)的m5C修飾。為探索NSUN2是否與SLC7A11 mRNA直接相互作用，作者進(jìn)行了RNA免疫沉淀（RIP）實(shí)驗(yàn)，然后進(jìn)行RT-qPCR，并觀察到相較于對照，NSUN2 RIP中SLC7A11 mRNA顯著富集（圖6F）。類似地，當(dāng)NSUN2被敲低，SLC7A11 mRNA顯示m5C修飾減少。然而，在NSUN2過度表達(dá)時，觀察到SLC7A11 mRNA相反的趨勢（圖6G）。鑒于NSUN2敲低導(dǎo)致SLC7A11 mRNA和蛋白質(zhì)水平降低，推斷NSUN2通過促進(jìn)m5C修飾增強(qiáng)SLC7A11 mRNA的穩(wěn)定性。因此，用放線菌素D（一種轉(zhuǎn)錄抑制劑）處理EC細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)NSUN2敲低后SLC7A11 mRNA的半衰期顯著降低（圖6H）。

       SLC7A11是半胱氨酸和谷氨酸的反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要輸入半胱氨酸用于谷胱甘肽生物合成和抗氧化防御。此外，SLC7A11的免疫組織化學(xué)染色圖像顯示，SLC7A12在EC中顯著過表達(dá)（圖6I）。此外，在TCGA UCEC數(shù)據(jù)集中，SLC7A11過表達(dá)，并且在mRNA水平上與NSUN2顯著正相關(guān)（圖6J和K）。

圖6：NSUN2調(diào)節(jié)SLC7A11 mRNA的m5C修飾以提高其mRNA穩(wěn)定性

7 SLC7A11 mRNA的m5C修飾識別和穩(wěn)定性維持依賴于YBX1

       先前已經(jīng)表明，m5C讀取器蛋白與mRNA上的m5C修飾位點(diǎn)結(jié)合，從而增強(qiáng)其穩(wěn)定性。使用生物素化的SLC7A11或m5C-SLC7A11 RNA探針進(jìn)行RNA pull-down，然后通過銀染和質(zhì)譜鑒定來檢查特異性探針結(jié)合蛋白。m5C閱讀器YBX1在RNA蛋白復(fù)合物中表現(xiàn)出顯著富集（圖7A和B）。結(jié)合蛋白質(zhì)印跡和RNA pull-down提供了額外的驗(yàn)證，即與未修飾的探針相比，m5C修飾的SLC7A11探針表現(xiàn)出對YBX1的結(jié)合親和力（圖7C）。此外，HEC-1B和KLE細(xì)胞中YBX1敲低導(dǎo)致SLC7A11 mRNA和蛋白質(zhì)水平降低（圖7D和E）。此外，RNA穩(wěn)定性測定還表明，YBX1敲低導(dǎo)致SLC7A11 mRNA穩(wěn)定性降低（圖7F）。接下來，作者使用YBX1抗體進(jìn)行RIP，然后進(jìn)行RT-qPCR。這意味著內(nèi)源性YBX1與SLC7A11 mRNA結(jié)合（圖7G）。YBX1的CSD負(fù)責(zé)識別和結(jié)合mRNA的m5C修飾位點(diǎn)，從而增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性。為確定YBX1的CSD結(jié)構(gòu)域是否對維持m5C修飾的SLC7A11 mRNA至關(guān)重要，構(gòu)建了含有三個FLAG標(biāo)記的、全長或CSD結(jié)構(gòu)域缺失的YBX1表達(dá)載體，研究結(jié)果表明， CSD缺失的YBX1過表達(dá)不能上調(diào)SLC7A11的蛋白水平（圖7H）。同樣地，SLC7A11在全長YBX1-RIP中富集，但在CSD結(jié)構(gòu)域缺失的YBX1-RP中不富集（圖7I）?；谶@些發(fā)現(xiàn)，YBX1似乎是一種m5C介體，通過m5C修飾穩(wěn)定SLC7A11 mRNA。

       免疫組化顯示，與正常子宮內(nèi)膜組織相比，YBX1在EC組織中頻繁過表達(dá)，并且YBX1和SLC7A11的水平在人類EC組織中呈正相關(guān)（圖7J和K）。在包括EC在內(nèi)的大多數(shù)惡性腫瘤中，全癌水平的TIMER數(shù)據(jù)庫分析揭示了YBX1和SLC7A11表達(dá)之間的正相關(guān)性。在TCGA UCEC數(shù)據(jù)集中，YBX1顯著過表達(dá)，并與不良預(yù)后密切相關(guān)。CPTAC數(shù)據(jù)庫還證實(shí)了子宮內(nèi)膜癌組織中YBX1蛋白水平上調(diào)。

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圖7：YBX1識別SLC7A11的m5C修飾并穩(wěn)定SLC7A11 mRNA

8 NSUN2通過上調(diào)SLC7A11促進(jìn)EC的鐵死亡抵抗和惡性進(jìn)展

       作者進(jìn)行了一系列挽救實(shí)驗(yàn)，以闡明NSUN2是否通過介導(dǎo)EC中SLC7A11的m5C修飾來調(diào)節(jié)鐵死亡。值得注意的是，在NSUN2敲低的HEC-1B和KLE細(xì)胞中SLC7A12表達(dá)恢復(fù)導(dǎo)致NSUN2基因敲低引起的SLC7A11下調(diào)逆轉(zhuǎn)（圖8A）。此外，SLC7A11部分逆轉(zhuǎn)了由NSUN2敲低引起的生長抑制，它還挽救了由NSUN2敲低誘導(dǎo)的細(xì)胞活力下降和細(xì)胞死亡增加（圖8B–D）。此外，SLC7A11有效降低了由NSUN2敲低觸發(fā)的脂質(zhì)ROS水平（圖8E和F）?？傊髡叩臄?shù)據(jù)表明，NSUN2主要通過增強(qiáng)SLC7A11 mRNA的穩(wěn)定性使EC細(xì)胞對鐵死亡產(chǎn)生抗性，并進(jìn)一步表明，靶向NSUN2/SLC7A111軸可能是EC的潛在有效治療方法。

圖8：EC中NSUN2通過SLC7A11依賴性機(jī)制促進(jìn)腫瘤進(jìn)展

9 SLC7A11對于NSUN2介導(dǎo)的EC細(xì)胞生長是必需的

       為進(jìn)一步證實(shí)NSUN2/SLC7A11軸在EC生長中的作用，使用用特定載體轉(zhuǎn)染的HEC-1B細(xì)胞在嚴(yán)重免疫缺陷的雌性BALB/c裸鼠中建立皮下異種移植物腫瘤模型。與體外結(jié)果一致，SLC7A11修復(fù)顯著逆轉(zhuǎn)了NSUN2敲低誘導(dǎo)的異種移植物腫瘤生長抑制（圖9A-C）。4-HNE的免疫組化用于評估異種移植物腫瘤中的脂質(zhì)過氧化物水平。結(jié)果顯示，由NSUN2敲低誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化增加被SLC7A11的表達(dá)部分挽救（圖第9D段）。

圖9：體內(nèi)NSUN2通過SLC7A11調(diào)節(jié)EC細(xì)胞鐵死亡

結(jié)論：

       本研究的一個重要發(fā)現(xiàn)是，EC中KDM5A表達(dá)降低導(dǎo)致NSUN2啟動子區(qū)內(nèi)H3K4me3甲基化升高，從而導(dǎo)致NSUN2轉(zhuǎn)錄激活。此外，NSUN2通過調(diào)節(jié)SLC7A11的m5C并以YBX1依賴的方式增強(qiáng)其mRNA穩(wěn)定性，賦予EC細(xì)胞對鐵死亡的抗性。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，靶向NSUN2/YBX1軸通過增強(qiáng)EC細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化和鐵死亡來抑制腫瘤生長。這些結(jié)果為鐵死亡調(diào)節(jié)機(jī)制提供了新的見解，并為EC患者的鐵死亡治療提供一種有前景的策略。

實(shí)驗(yàn)方法：

       細(xì)胞培養(yǎng)，載體構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染，RNA提取及RT-qPCR，Western blot, ChIP，CUT&Tag，RIP與m5C mRNA免疫沉淀，m5C的斑點(diǎn)印跡分析，RNA亞硫酸氫鹽測序，RNA測序，RNA穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，RNA pull down，銀染，質(zhì)譜（MS）分析，透射電鏡，腫瘤異種移植物模型，免疫組化，脂質(zhì)活性氧（ROS）測量，細(xì)胞增殖和活力測定

參考文獻(xiàn)：

       Chen SJ, Zhang J, Zhou T, Rao SS, Li Q, Xiao LY, Wei ST, Zhang HF. Epigenetically upregulated NSUN2 confers ferroptosis resistance in endometrial cancer via m5C modification of SLC7A11 mRNA. Redox Biol. 2023 Nov 29;69:102975. doi: 10.1016/j.redox.2023.102975. Epub ahead of print. PMID: 38042059.