ADAM12調(diào)控的巨噬細(xì)胞胞葬促進(jìn)抗腫瘤免疫

       本研究中，作者在黑色素瘤、胰腺癌癥和癌癥小鼠模型的腫瘤邊緣鑒定到誘導(dǎo)的慢循環(huán)ADAM12+ PDGFRα+間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（MSC）。使用誘導(dǎo)型譜系追蹤和轉(zhuǎn)錄組學(xué)，證明代謝改變的ADAM12+ MSC通過過表達(dá)Gas6、Lgals3和Csf1等基因促進(jìn)巨噬細(xì)胞胞葬和極化，從而誘導(dǎo)病理性血管生成和免疫抑制。ADAM12+細(xì)胞的基因缺失恢復(fù)了功能性腫瘤血管，減少了缺氧和酸中毒，使CAF正?；?，誘導(dǎo)效應(yīng)T細(xì)胞浸潤，并抑制黑色素瘤和胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌癥的生長，這一過程依賴于TGF-β。在人類癌癥中，ADAM12對(duì)具有高水平缺氧和先天耐藥機(jī)制的患者以及與不良預(yù)后和耐藥性相關(guān)的因素（如AXL）進(jìn)行了分層?？傊@些數(shù)據(jù)表明，通過ADAM12耗竭腫瘤誘導(dǎo)的慢循環(huán)PDGFRa+ MSC可以恢復(fù)抗腫瘤免疫。該研究于2023年10月發(fā)表在《nature immunology》，IF 30.5。

技術(shù)路線：

主要研究內(nèi)容：

1 ADAM12+ MSCs基因缺失恢復(fù)腫瘤免疫

       為了在腫瘤發(fā)生過程中觀察到ADAM12+細(xì)胞，作者用B16-OVA黑色素瘤細(xì)胞（MO5）皮下接種ADAM12-GFP小鼠。觀察到ADAM12+ MSC（表達(dá)GFP）特異性定位于腫瘤邊緣，這是一個(gè)富含基質(zhì)細(xì)胞的過渡區(qū)，表達(dá)不同水平的PDPN和平滑肌肌動(dòng)蛋白α2（αSMA+）、膠原細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）、T細(xì)胞、CD206+ 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）和血管（圖1a、b）。ADAM12在正常皮膚或CD45+腫瘤免疫細(xì)胞、CD31+內(nèi)皮細(xì)胞或PDPN– PDGFRα–基質(zhì)細(xì)胞中未檢測(cè)到，但其在腫瘤周圍血管附近的2-8%的PDGFRα+ PDPN+細(xì)胞中被誘導(dǎo)表達(dá)。ADAM12+細(xì)胞頻率和絕對(duì)數(shù)量在腫瘤晚期降低（圖1b、c）。ADAM12+ MSCs是PDGFRβ+、αSMA-和NG2lo或NG2-（一種周細(xì)胞標(biāo)記物），且定位于ColiV+血管基底膜（BM）外，與周細(xì)胞形成對(duì)比。為了耗盡ADAM12+ MSC，作者用MO5黑色素瘤細(xì)胞接種ADAM12- DTR小鼠；在這些小鼠中，白喉毒素受體（DTR）在Adam12啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。從腫瘤植入后10天開始，當(dāng)腫瘤可觸及時(shí)，ADAM12+細(xì)胞耗竭導(dǎo)致50%的腫瘤生長抑制（圖1d）。相反，在腫瘤發(fā)生的初始階段，ADAM12+細(xì)胞的耗竭并不能抑制腫瘤生長（圖1e），這與基質(zhì)細(xì)胞的初始飼養(yǎng)作用相反。從第10天起，缺乏ADAM12+細(xì)胞的腫瘤干擾素-γ（IFN-γ）產(chǎn)生CD8+ T細(xì)胞和自然殺傷（NK）細(xì)胞浸潤增加（圖1f），而CD4+ T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（DC）、髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs）或總巨噬細(xì)胞的浸潤沒有觀察到差異。在缺乏ADAM12+細(xì)胞的情況下，用CD8+ T細(xì)胞消耗抗體處理恢復(fù)了腫瘤生長，證實(shí)ADAM12+細(xì)胞阻斷了CD8+ T細(xì)胞的抗腫瘤活性。

圖1：ADAM12+ MSCs基因缺失恢復(fù)腫瘤免疫

2 ADAM12+ MSCs缺失使基質(zhì)和血管TME正?；?/span>

       與活性抗腫瘤免疫反應(yīng)一致，T細(xì)胞浸潤到ADAM12+細(xì)胞缺失的腫瘤中心，靠近PDPN+ CAF，PDPN+ CAFs在腫瘤內(nèi)遷移并在血管附近定居（圖2a、b、d）。在耗盡和對(duì)照條件下，靠近PDPN+ CAF的T細(xì)胞頻率相似，與PDPN+ CAFs具有增加募集T細(xì)胞的能力相反。PDPN+ CAF的頻率和絕對(duì)數(shù)量在兩種條件下相似（圖2c），表明CAFs對(duì)T細(xì)胞是允許的。為鑒定T細(xì)胞浸潤的腫瘤中PDPN+ CAF發(fā)生的變化，對(duì)從野生型（WT）腫瘤（浸潤不良）或缺乏ADAM12+細(xì)胞（浸潤高度）的腫瘤中分離的PDPN+PDGFRα+細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq基因表達(dá)分析。在這兩種條件下，PDPN+ PDGFRα+細(xì)胞中的差異基因表達(dá)分析確定了一些基因，包括Car9、Saa3、Lcn2、Mmp9和Mmp13，它們?cè)谌狈?span>ADAM12+細(xì)胞的腫瘤CAFs中顯著下調(diào)（DTR與對(duì)照）（圖2e）。這些基因都具有公認(rèn)的抗癌作用，它們的表達(dá)通常是由缺氧誘導(dǎo)的。缺氧誘導(dǎo)的Car9（碳酸酐酶9，CAIX）通過催化二氧化碳水合為碳酸氫根離子和質(zhì)子來防止胞質(zhì)酸化。CAIX的表達(dá)增強(qiáng)了缺氧條件下的細(xì)胞存活，并增加了腫瘤微環(huán)境的酸化，這是一種主要的免疫抑制因子。與ADAM12+細(xì)胞在腫瘤缺氧和酸中毒中的作用一致，缺乏這些細(xì)胞的腫瘤顯示出缺氧減少（圖2f）和細(xì)胞外pH增加（圖2g）。當(dāng)在缺乏ADAM12+細(xì)胞的情況下恢復(fù)氧水平時(shí)，Car9在整個(gè)腫瘤中的表達(dá)顯著降低（圖2h）。為研究僅使腫瘤微環(huán)境的pH正?；欠褡阋曰謴?fù)腫瘤免疫，作者用CAIX抑制劑U-104處理攜帶MO5黑色素瘤的WT小鼠。作者觀察到，盡管CAIX抑制使細(xì)胞外腫瘤pH正常化至與ADAM12+細(xì)胞耗竭相似的水平（圖2g），但抗腫瘤免疫沒有恢復(fù)。此外，與缺乏ADAM12+細(xì)胞的腫瘤相比，U-104治療的腫瘤仍然缺氧。腫瘤缺氧主要是由于功能差、腫瘤血管系統(tǒng)塌陷，缺乏周細(xì)胞覆蓋，而周細(xì)胞覆蓋是正常血管成熟和功能所必需的。與血管系統(tǒng)的正常化一致，缺乏ADAM12+細(xì)胞的腫瘤血管恢復(fù)了NG2+周細(xì)胞覆蓋水平和寬度增加（圖2i），以及ICAM1表達(dá)增加（圖2j），這對(duì)白細(xì)胞粘附和跨內(nèi)皮遷移至關(guān)重要，并改善了腫瘤灌注（圖2k）。值得注意的是，在ADAM12+細(xì)胞缺乏的腫瘤中，PDPN+ PDGFRα+細(xì)胞中上調(diào)的基因包括了PDGF和BMP信號(hào)的調(diào)節(jié)因子（圖2e），這些上調(diào)基因也參與血管成熟和正常化。

       先前對(duì)小鼠黑色素瘤的單細(xì)胞RNA-seq（scRNA-seq）研究確定了三簇CAFs，稱為免疫/炎癥DPP4+ CD34hi基質(zhì)（S1）、促結(jié)締組織增生基質(zhì)（S2）和收縮基質(zhì)/周細(xì)胞（S3）。在缺乏ADAM12+細(xì)胞的腫瘤中，觀察到S1細(xì)胞頻率顯著降低，而S2和S3的頻率增加。由于S3亞群和S2亞群中CAFs表達(dá)的周細(xì)胞標(biāo)記物Rgs5和Cspg4（編碼NG2）水平高于S1亞群，這些數(shù)據(jù)與在ADAM12+細(xì)胞缺失的腫瘤中觀察到的周細(xì)胞覆蓋率增加一致（圖2i）。作者進(jìn)一步研究了這一機(jī)制。S1 CAFs的減少可能不是由于ADAM12+細(xì)胞的直接消融，因?yàn)榇蠖鄶?shù)ADAM12+的DPP4表達(dá)較低或不表達(dá)，CD34表達(dá)中等或較低，與之前的scRNA-seq數(shù)據(jù)一致，并且占總基質(zhì)細(xì)胞的一小部分（圖1c）。因?yàn)?span>ADAM12+細(xì)胞的消融減少了腫瘤缺氧（圖2f），那么缺氧是否影響CAF向S1的分化。作者觀察到缺氧誘導(dǎo)了Cd34、Dpp4、C3、Il6ra和Il6st（S1基質(zhì)群體的標(biāo)記基因；）在體外基質(zhì)細(xì)胞中的上調(diào)，而編碼廣泛成纖維細(xì)胞標(biāo)記物的基因（如Pdgfra和Pdpn）的表達(dá)水平不受影響。這些數(shù)據(jù)與先前的報(bào)告一致，這些報(bào)告顯示炎癥性CAFs在腫瘤缺氧區(qū)域富集，并進(jìn)一步表明ADAM12+ MSCs的缺失通過減少腫瘤缺氧使CAFs正?；?。

圖2：ADAM12+ MSCs耗竭使基質(zhì)/血管TME正?；?/span>

3慢循環(huán)ADAM12+ MSCs以TGF-β依賴的方式調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境（TME）

       這些數(shù)據(jù)表明，在腫瘤邊緣早期發(fā)育的ADAM12+ MSCs的一小部分強(qiáng)烈影響血管和基質(zhì)腫瘤的微環(huán)境。為研究潛在機(jī)制，在第8天對(duì)從MO5黑色素瘤中分離的ADAM12+細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。差異基因表達(dá)分析確定，與ADAM12–PDPN+ PDGFRα+細(xì)胞相比，ADAM12+ PDPN+ PDGFRα+細(xì)胞中有>700個(gè)基因顯著上調(diào)（圖3a）?；蚣患治霰砻鳎?span>ADAM12+細(xì)胞最富集通路的術(shù)語是ECM重塑、細(xì)胞增殖和分化以及炎癥相關(guān)，包括生長因子受體（RTK）和細(xì)胞因子受體下游的主要信號(hào)通路，如磷酸肌醇3-激酶（PI3K）-Akt、MAPK、核因子-κB（NF-κB），腫瘤壞死因子（TNF）和JAK–STAT信號(hào)通路（圖3b）。與ADAM12-細(xì)胞相比，ADAM12+細(xì)胞中與細(xì)胞代謝、蛋白質(zhì)合成和DNA復(fù)制相關(guān)的幾種途徑下調(diào)（圖3c）。在具有較低代謝的ADAM12+細(xì)胞腫瘤系中，ADAM12+細(xì)胞中參與細(xì)胞增殖、糖酵解和氧化磷酸化的基因表達(dá)下調(diào)，如Mcm2、Cdk2、Cdk15、Ldhb、Ldha和Atp5a1，而Gadd45b、Gadd45g和Gpx3表達(dá)上調(diào)，這些基因在細(xì)胞周期停滯時(shí)被誘導(dǎo)以響應(yīng)氧化或應(yīng)激損傷（圖3d）。進(jìn)一步表明TME內(nèi)存在串?dāng)_，ADAM12+細(xì)胞表達(dá)更高水平的Pdgfra、Il1r1（編碼NF-κB的激活劑）、Osmr和Il6st（gp130），這些基因編碼涉及多種細(xì)胞因子受體復(fù)合物中的信號(hào)傳感器，包括抑癌素（OSM）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）（圖3d）。它們還上調(diào)Il6、編碼包括Cxcl1在內(nèi)的趨化因子基因，以及在單核細(xì)胞募集和巨噬細(xì)胞極化中起關(guān)鍵作用的基因，如Ccl2、Ccl7、Csf1和Has2（圖3d），以及生長停滯特異性6（Gas6）、Lgals3和Pros1，它們通過TAM（TYRO3、AXL和MERTK）酪氨酸激酶受體促進(jìn)巨噬細(xì)胞胞葬。此外，ADAM12+細(xì)胞上調(diào)編碼粘附分子的Icam1和ECM的促腫瘤成分，如Ctgf、Lox、Hspg2、Mmp3和Tgfbr3（圖3d），表明這些細(xì)胞在TME重塑中發(fā)揮作用。與ADAM12– PDGFRα+細(xì)胞相比，ADAM12+ PDGFRα+細(xì)胞上調(diào)間充質(zhì)祖細(xì)胞過表達(dá)的基因，如Ngfr、Ly6a（sca-1）、Vcam1（CD106）和PDGFRβ，但不上調(diào)Acta2（編碼αSMA）或Lrrc15。這些數(shù)據(jù)表明，ADAM12+細(xì)胞是不同于αSMA+肌成纖維細(xì)胞和Lrrc15+ CAFs的血管周間充質(zhì)祖細(xì)胞。

       與CAF群體相比，大多數(shù)ADAM12+ MSC不表達(dá)Ki-67或不合并Edu（圖3e），這與細(xì)胞處于緩慢循環(huán)狀態(tài)一致。衰老標(biāo)記物的缺失，如Cdkn2a（p16-INK4A）和Cdkn1a（P21），與衰老狀態(tài)相反，其特征是細(xì)胞增殖和生長的不可逆停滯。因此，與對(duì)有絲分裂刺激無反應(yīng)的衰老細(xì)胞不同，ADAM12+ MSC在體外給予營養(yǎng)時(shí)迅速恢復(fù)細(xì)胞增殖（圖3f）。TGF-β在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。除了誘導(dǎo)Adam12的表達(dá)，TGF-β在從MO5腫瘤中分離的Adam12– PDGFRα+ PDPN+細(xì)胞中快速誘導(dǎo)編碼周期阻滯蛋白Gadd45b和Gadd45g的表達(dá)，并下調(diào)參與細(xì)胞增殖的細(xì)胞周期蛋白，如Cdk6編碼的細(xì)胞周期蛋白（圖3g）。ADAM12+細(xì)胞過表達(dá)許多編碼炎性細(xì)胞因子和生長因子受體的基因（圖3d），包括Il1r1、Osmr和Il6st，表明TME內(nèi)存在額外的串?dāng)_。在TME中，TAMs表達(dá)最高水平的Il1b、Osm和Pdgfc。盡管IL-1β和OSM沒有誘導(dǎo)Adam12的表達(dá)，但IL-1β在從MO5腫瘤分離的Adam12+ MSC中誘導(dǎo)Cxcl1、Ccl2、Il6和Mmp3的表達(dá)，OSM快速誘導(dǎo)Il6、Icam1、Has2、Il1r1和Gadd45g的表達(dá)（圖3h）?；|(zhì)細(xì)胞中的饑餓強(qiáng)烈誘導(dǎo)了ADAM12+細(xì)胞過表達(dá)的其他因子，如Gas6，總體上表明炎癥和營養(yǎng)缺乏的TME進(jìn)一步調(diào)節(jié)了TGF-β誘導(dǎo)的ADAM12+細(xì)胞表型。

       Tgfb1在早期腫瘤階段被TME中的幾種細(xì)胞類型上調(diào)，并且TAMs是晚期腫瘤中Tgfb1的主要產(chǎn)生者。由于ADAM12+細(xì)胞表達(dá)高水平的Tgfb1，和ADAM12在體外增強(qiáng)TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)，作者在體內(nèi)研究了TGFBR2在MO5腫瘤中ADAM12+細(xì)胞中的作用。通過將ADAM12-tTA小鼠與tet對(duì)照的Cre（LC-1小鼠）和Tgfbr2loxP/loxP小鼠（ADAM12-tTA-CreTgfbr2小鼠）雜交，在ADAM12+細(xì)胞中產(chǎn)生四環(huán)素調(diào)節(jié)的Tgfbr2消融模型。由于TGF-β的表達(dá)在腫瘤早期被誘導(dǎo)，作者在腫瘤發(fā)生初期通過去除多西環(huán)素開始消融ADAM12+細(xì)胞中的Tgfbr2。與WT同窩出生的小鼠相比，在ADAM12-tTA-CreTgfbr2小鼠中觀察到腫瘤生長的顯著抑制以及T細(xì)胞浸潤的增加，表明TGFBR2是ADAM12+細(xì)胞促腫瘤作用所必需的。從ADAM12-tTA-CreTgfbr2小鼠MO5腫瘤中分離的巨噬細(xì)胞表達(dá)較低水平的Vegfa，這是滲漏血管的主要誘導(dǎo)物，并且腫瘤血管改善了周細(xì)胞覆蓋率，與血管正?；恢?。因此，與從野生型腫瘤中分離的基質(zhì)細(xì)胞相比，從ADAM12-tTA-CreTgfbr2小鼠MO5腫瘤中分離出的基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)更高水平的Angpt1和Pdgfrb，其通過周細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞相互作用穩(wěn)定血管系統(tǒng)，并低水平表達(dá)缺氧誘導(dǎo)的Car9。這些數(shù)據(jù)表明，ADAM12+細(xì)胞中的TGFBR2信號(hào)傳導(dǎo)是其促腫瘤功能和TME改變所必需的。

圖3：慢循環(huán)ADAM12+ MSCs促進(jìn)腫瘤前炎癥和組織重塑

4 ADAM12+ MSCs促進(jìn)巨噬細(xì)胞胞葬和極化

       進(jìn)一步表明ADAM12+ MSC和巨噬細(xì)胞之間存在串?dāng)_，ADAM12+細(xì)胞從早期腫瘤階段開始在靠近CD206+ TAM的MO5腫瘤周圍積累（圖4a）。在較大的腫瘤中，ADAM12+細(xì)胞仍定位在腫瘤邊緣，大多數(shù)（>80%）與具有磷酸化AXL的巨噬細(xì)胞非常接近（AXL-P+，圖4b），這是一種對(duì)胞葬至關(guān)重要的受體，并且遠(yuǎn)離T細(xì)胞。相比之下，只有20-40%的CAFs與AXL-P+巨噬細(xì)胞相鄰。巨噬細(xì)胞通過胞葬作用吞噬凋亡細(xì)胞，誘導(dǎo)抗炎細(xì)胞因子，如TGF-β、IL-10和前列腺素E2（PGE2），促進(jìn)腫瘤發(fā)生。胞吐作用由諸如Gas6的分子增強(qiáng)，Gas6將凋亡細(xì)胞上的磷酸腺苷絲氨酸與TAM受體橋接。值得注意的是，與在腫瘤巨噬細(xì)胞上以較低水平表達(dá)的Mertk或Tyro3受體相比，Gas6對(duì)AXL受體具有更高的親和力（圖4c）。與作者的測(cè)序數(shù)據(jù)一致的是，PDPN+ PDGFRα+細(xì)胞在腫瘤中具有高于其他細(xì)胞類型的Gas6表達(dá)水平；ADAM12+ PDPN+ PDGFRα+細(xì)胞在RNA和蛋白水平上均具有特別高的Gas6表達(dá)水平（圖4d，e）。盡管CAFs沒有顯示出胞葬活性，但MO5腫瘤分離的ADAM12+ MSCs（GFP+細(xì)胞）條件培養(yǎng)基（CM）增加了骨髓來源巨噬細(xì)胞（BMDMs）的胞葬活性，髓系細(xì)胞中的骨髓源性巨噬細(xì)胞（從LysM-CreAXLfl/fl小鼠中分離）中缺乏AXL時(shí)，這種作用被抑制（圖4f）。與來自GFP-細(xì)胞CM處理的BMDM相比，GFP+細(xì)胞CM處理的滲出細(xì)胞BMDM表達(dá)更高水平的Tgfb1、Vegfa和Il10，與胞葬誘導(dǎo)的免疫抑制一致。體內(nèi)也發(fā)生了類似的過程：ADAM12+細(xì)胞耗竭誘導(dǎo)AXL-P+巨噬細(xì)胞顯著減少（圖4g），而凋亡細(xì)胞（主要是非血管周圍和非基質(zhì)細(xì)胞）頻率增加（圖4h）。因此，與從WT腫瘤中分離的巨噬細(xì)胞相比，從缺乏ADAM12+細(xì)胞腫瘤中分離出的巨噬細(xì)胞吞噬能力降低。與WT腫瘤相比，這些數(shù)據(jù)與ADAM12+細(xì)胞缺失腫瘤中Gas6的表達(dá)降低一致，表明ADAM12+細(xì)胞是TME中Gas6的重要來源。與ADAM12+細(xì)胞在體內(nèi)這一過程中的作用一致，在缺乏ADAM12+ MSC的腫瘤中，主要組織相容性復(fù)合體II（MHCII）hi CD206lo炎癥巨噬細(xì)胞與MHCIIlo CD206hi TAMs的比率顯著增加（圖4i）。從缺乏ADAM12+細(xì)胞的腫瘤中分離的巨噬細(xì)胞表達(dá)較低水平的Tgfb1、Il10、Ptgs2（編碼PGE2）和Vegfa（圖4j）和上調(diào)的Light（Tnfsf14），其通過激活NK細(xì)胞、T細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和恢復(fù)血管完整性來促進(jìn)抗腫瘤免疫。因此，抗AXL激活抗體在缺乏ADAM12+細(xì)胞的MO5腫瘤中恢復(fù)了腫瘤進(jìn)展，并將AXL-P+巨噬細(xì)胞水平增加到WT小鼠水平（圖4k，l），它對(duì)WT腫瘤沒有影響?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)表明ADAM12+ MSC在腫瘤早期被誘導(dǎo)，并通過促進(jìn)胞葬作用使腫瘤巨噬細(xì)胞極化為免疫抑制和促血管生成表型。

圖4：ADAM12+ MSCs通過促進(jìn)胞葬作用誘導(dǎo)免疫抑制的巨噬細(xì)胞

5腫瘤誘導(dǎo)的ADAM12+譜系在晚期維持

       為確定ADAM12+ MSCs是否在自發(fā)發(fā)生的腫瘤中發(fā)育，將ADAM12-GFP小鼠與Rip-Tag2小鼠（一種神經(jīng)內(nèi)分泌胰腺腫瘤的小鼠模型）或TRAMP小鼠（前列腺腺癌的小鼠模型）。在這些模型中，SV40大T抗原表達(dá)驅(qū)動(dòng)多步腫瘤進(jìn)展，腫瘤分期與人類癌癥相似。在這兩種腫瘤中，都觀察到PDPN+基質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在腫瘤周圍區(qū)域積聚。作者觀察到約1-6%的基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)ADAM12，并定位在Rip-Tag2和TRAMP腫瘤邊緣的血管附近，但不在正常胰腺或前列腺中（圖5a、b）。與黑色素瘤中發(fā)生的情況類似，與ADAM12-細(xì)胞相比，ADAM12+細(xì)胞上調(diào)參與細(xì)胞周期停滯、生長因子和細(xì)胞因子受體的基因，以及上調(diào)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞和ECM的基因，包括Gas6、Csf1、Has2、Mmp3和間充質(zhì)祖細(xì)胞標(biāo)志物Ly6a和Vcam1，以及下調(diào)Mki67、Cdk1，Cdkn2a和Acta2。ADAM12+細(xì)胞表達(dá)低至中等水平的PDGFRβ，并定位于ColIV+血管BM外（圖5a）。為確定腫瘤進(jìn)展過程中ADAM12+ MSC在體內(nèi)的命運(yùn)，通過將ADAM12-tTA小鼠27與LC-1小鼠和Rosa26STOPfloxYFP報(bào)告小鼠（ADAM12tTA-CreYFP小鼠，圖5c）雜交，產(chǎn)生ADAM12+細(xì)胞的四環(huán)素調(diào)節(jié)譜系追蹤系統(tǒng)。在ADAM12-tTA-CreYFP小鼠中接種MO5腫瘤細(xì)胞后（多西環(huán)素維持直到腫瘤注射），作者觀察到黃色熒光蛋白（YFP）+細(xì)胞（ADAM12+細(xì)胞的后代）構(gòu)成了晚期黑色素瘤中約1%的基質(zhì)細(xì)胞。YFP+細(xì)胞定位于腫瘤邊緣、靠近血管和基質(zhì)內(nèi)，并表達(dá)不同水平的NG2和αSMA。與ADAM12+細(xì)胞相比，YFP+細(xì)胞下調(diào)了免疫細(xì)胞串?dāng)_所必需的幾種因子，包括Ccl2、Csf1、Gas6、Lgals3、Cxcl12、Il1r1、Osmr、Il6和Angpt1，同時(shí)上調(diào)不同水平的Car9、Angpt2、Acta2和Pdgfrb。由于Car9和Angpt2編碼阻斷抗腫瘤免疫的蛋白質(zhì)，這些數(shù)據(jù)表明ADAM12+細(xì)胞及其子代都促進(jìn)免疫抑制，盡管機(jī)制不同。為確定類似的譜系是否在自發(fā)產(chǎn)生的腫瘤中發(fā)展，作者將ADAM12-tTA-CreYFP小鼠（圖5c）與TRAMP小鼠或Rip-Tag2小鼠雜交。在前列腺和胰腺腫瘤中，觀察到基質(zhì)內(nèi)和血管附近YFP+細(xì)胞表達(dá)中低水平的αSMA和NG2（圖5e）。盡管它們靠近血管，但與周細(xì)胞相反，YFP+細(xì)胞定位在血管BM外，與分離的周細(xì)胞樣細(xì)胞或血管周αSMAmid成纖維細(xì)胞一致。通過在腫瘤發(fā)生的不同階段去除多西環(huán)素（圖5d），觀察到與晚期腫瘤階段ADAM12＋細(xì)胞相比，在前列腺和胰腺腫瘤的早期腫瘤階段誘導(dǎo)的ADAM12+細(xì)胞具有增加基質(zhì)祖細(xì)胞潛能（圖5f）。多西環(huán)素處理之后，10周齡TRAMP×ADAM12-tTA-CreYFP小鼠，從第4周開始繪制命運(yùn)圖譜（圖5g），作者分析了腫瘤早期特異性誘導(dǎo)的ADAM12+細(xì)胞命運(yùn)。在這種情況下，在30周大的TRAMP小鼠中觀察到較大前列腺腺癌腫瘤邊緣中的YFP+ αSMA-或YFP+β SMAmid細(xì)胞，證明在早期腫瘤中誘導(dǎo)的ADAM12+細(xì)胞產(chǎn)生了在腫瘤進(jìn)展中維持的旁癌細(xì)胞系（圖5h）。

       根據(jù)基因表達(dá)數(shù)據(jù)，YFP+細(xì)胞大多對(duì)增殖標(biāo)記物Ki-67呈陰性（圖5e，右圖）。TRAMP×ADAM12-tTA-CreYFP小鼠中，在正常組織和轉(zhuǎn)移到肝臟、骨骼的SV40+前列腺癌細(xì)胞的界面處也存在大量慢循環(huán)YFP+Ki-67細(xì)胞（圖5i），進(jìn)一步表明ADAM12+ MSC在癌轉(zhuǎn)移中的作用。為研究腫瘤誘導(dǎo)的ADAM12+ MSC的發(fā)育起源，從發(fā)育開始對(duì)ADAM12+細(xì)胞進(jìn)行譜系追蹤，因?yàn)?span>ADAM12在器官形態(tài)發(fā)生過程中表達(dá)。在ADAM12-CreYFP小鼠中，作者觀察到成人健康皮膚、前列腺和胰腺中的大多數(shù)基質(zhì)細(xì)胞是由胎兒ADAM12+祖細(xì)胞產(chǎn)生的，表明腫瘤發(fā)生重新激活了發(fā)育程序。最后，為評(píng)估ADAM12+ MSCs在自發(fā)性腫瘤模型中的作用，將ADAM12-DTR小鼠與Rip-Tag2小鼠雜交，產(chǎn)生Rip+DTR+和Rip+TTR-小鼠。ADAM12+細(xì)胞的耗竭誘導(dǎo)RIP腫瘤的顯著生長抑制，顯示CD3+ T細(xì)胞浸潤增加。如在黑色素瘤中觀察到的，PDPN+ PDGFRα+ CAF被重組，但在缺乏ADAM12+ MSC的腫瘤中仍以相似的數(shù)量存在，并且血管系統(tǒng)顯示出周細(xì)胞覆蓋率和ICAM1表達(dá)增加。這些數(shù)據(jù)表明，腫瘤發(fā)生的早期階段誘導(dǎo)的慢循環(huán)ADAM12+ PDGFRα+ αSMA-血管周圍MSCs產(chǎn)生了一個(gè)離散的間充質(zhì)譜系，該譜系在晚期癌癥和轉(zhuǎn)移中保持并活躍。

圖5：腫瘤誘導(dǎo)的ADAM12+譜系在晚期腫瘤階段維持

6 ADAM12能夠?qū)Σ煌[瘤類型的癌癥患者進(jìn)行分層

       ADAM12在幾種實(shí)體瘤中過表達(dá)，包括黑色素瘤、前列腺、乳腺、肝臟、結(jié)直腸和胰腺腫瘤，并與基質(zhì)激活和不良預(yù)后有關(guān)。如在小鼠模型中觀察到的，ADAM12在幾種人類腫瘤中優(yōu)先由基質(zhì)群體表達(dá)，與之前的報(bào)道一致。在人類胰腺導(dǎo)管腺癌中，ADAM12的表達(dá)與“基質(zhì)活化”亞型相關(guān)，后者與嚴(yán)重預(yù)后相關(guān)。作者進(jìn)一步分析了來自皮膚黑色素瘤、胰腺導(dǎo)管腺癌、前列腺腺癌或結(jié)腸癌患者隊(duì)列的公開數(shù)據(jù)集中ADAM12的表達(dá)。對(duì)于每個(gè)隊(duì)列，通過ADAM12表達(dá)對(duì)腫瘤進(jìn)行分層（ADAM12表達(dá)<中值表達(dá)與ADAM12表達(dá)>中值表達(dá)）。富集分析表明ADAM12hi腫瘤顯著富集與炎癥反應(yīng)、缺氧和血管生成相關(guān)的基因，并且與氧化磷酸化呈負(fù)相關(guān)（圖6a）。使用GO和KEGG分析進(jìn)一步表明“細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用”、“ECM-受體相互影響”、“組織重塑”和“傷口愈合調(diào)節(jié)”的通路富集（圖6a，b）。對(duì)“細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用”、“ECM-受體相互影響”、“炎癥反應(yīng)”和“組織重塑”通路的分析進(jìn)一步確定了四個(gè)腫瘤數(shù)據(jù)集中多個(gè)共享基因（圖6b-e），這表明在按照ADAM12表達(dá)分組的實(shí)體瘤中存在共享的基因表達(dá)程序。值得注意的是，與在小鼠模型中獲得的數(shù)據(jù)相似，四個(gè)人類數(shù)據(jù)集中前沿常見基因包括調(diào)節(jié)或表達(dá)腫瘤巨噬細(xì)胞的基因，如AXL、CSF1、CSF1R、CD14和MSR1，以及編碼OSM、IL-6和PDGF途徑的細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的基因，以及編碼在組織重塑和血管生成中起重要作用的ECM結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)蛋白的基因，包括膠原蛋白、層粘連蛋白、HSPG2、HAS2、KDR和NOX4。與增加的耐藥性機(jī)制一致，由ADAM12表達(dá)對(duì)人類前列腺癌的分層進(jìn)一步與Gleason評(píng)分相關(guān)，該評(píng)分確定了高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的高級(jí)別腫瘤。這些數(shù)據(jù)表明，在包括胰腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌癌癥在內(nèi)的幾種促結(jié)締組織增生性腫瘤中，ADAM12的表達(dá)對(duì)腫瘤患者進(jìn)行了分層，這些腫瘤具有高水平的缺氧、炎癥、組織重塑和先天性耐藥性機(jī)制，以及與不良預(yù)后和耐藥性相關(guān)的因素，如AXL。

圖6：ADAM12對(duì)不同腫瘤類型具有高水平缺氧、炎癥和先天抵抗機(jī)制的患者進(jìn)行分層

結(jié)論：

       在這里，作者發(fā)現(xiàn)腫瘤誘導(dǎo)的腫瘤邊緣基質(zhì)細(xì)胞周期停滯協(xié)調(diào)了血管生成、組織重塑和免疫抑制，這是腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。通過ADAM12的表達(dá)鑒定，這種代謝改變的間充質(zhì)基質(zhì)亞群的選擇性耗竭使TME正常化，并減少腫瘤缺氧和酸中毒，誘導(dǎo)活化T細(xì)胞浸潤和抑制腫瘤生長。作者進(jìn)一步提供了直接的遺傳學(xué)證據(jù)，證明ADAM12+ MSC中的TGFBR2信號(hào)傳導(dǎo)是其促腫瘤功能所必需的。

實(shí)驗(yàn)方法：

       小鼠腫瘤模型，免疫熒光，細(xì)胞培養(yǎng)，胞葬實(shí)驗(yàn)，qRT–PCR，RNA測(cè)序，單細(xì)胞測(cè)序

參考文獻(xiàn)：

       Di Carlo SE, Raffenne J, Varet H, Ode A, Granados DC, Stein M, Legendre R, Tuckermann J, Bousquet C, Peduto L. Depletion of slow-cycling PDGFRα+ADAM12+ mesenchymal cells promotes antitumor immunity by restricting macrophage efferocytosis. Nat Immunol. 2023 Nov;24(11):1867-1878. doi: 10.1038/s41590-023-01642-7. Epub 2023 Oct 5. PMID: 37798557; PMCID: PMC10602852.