胰腺癌致癌因子—BHLHE40上調(diào)SREBF1抑制癌細(xì)胞鐵死亡

        胰腺癌（PCa）是最致命的人類(lèi)惡性腫瘤之一。間質(zhì)組織向PCa腫瘤微環(huán)境浸潤(rùn)的增強(qiáng)限制了惡性上皮細(xì)胞中關(guān)鍵腫瘤特異性轉(zhuǎn)錄因子和表觀基因組異常的鑒定。對(duì)胰腺癌類(lèi)器官的整合轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳多組學(xué)分析表明，堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子40（BHLHE40）在腫瘤樣本中顯著上調(diào)。BHLHE40不僅作為經(jīng)典轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合因子1（SREBF1）的轉(zhuǎn)錄，而且連接SREBF1的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子區(qū)域。BHLHE40-SREBF1-硬脂酰輔酶A去飽和酶軸保護(hù)PCa細(xì)胞免受鐵死亡，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化的積累減少。此外，SREBF1抑制劑fatostatin顯著抑制BHLHE40高表達(dá)的PCa腫瘤的生長(zhǎng)。該研究于2023年12月發(fā)表在《Advanced Science》，IF：15.1。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. 胰腺癌患者來(lái)源的類(lèi)器官中BHLHE40位點(diǎn)的開(kāi)放染色質(zhì)

        使用ATAC-seq和CUT&Tag H3K27ac修飾譜分析兩對(duì)腫瘤（PTO1和PTO2）和癌旁（PNO1和PNO2）組織類(lèi)器官（圖1A）。通過(guò)評(píng)估TCGA中PAAD數(shù)據(jù)集的mRNA-seq中差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子組的基因的交集，以及PCa類(lèi)器官中增強(qiáng)的結(jié)合位點(diǎn)的H3K27ac CUT&Tag分析和上調(diào)的可及性增強(qiáng)區(qū)域的ATAC-seq分析確定了一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（BHLHE40），用于進(jìn)一步研究（圖1A）。與PNOs相比，在PCa類(lèi)器官中，H3K27ac富集于BHLHE40的啟動(dòng)子區(qū)域（圖1B）。EP300沉默或抑制（使用C646作為抑制劑）持續(xù)降低PANC-1和BxPC-3細(xì)胞系中BHLHE40的H3K27ac表達(dá)水平（圖1C）。因此得出結(jié)論，EP300介導(dǎo)的H3K27ac修飾參與BHLHE40的上調(diào)。由于BHLHE40在肝細(xì)胞中的誘導(dǎo)被mTOR信號(hào)的抑制劑雷帕霉素所阻止，隨后研究了mTOR信號(hào)對(duì)BHLHE40的影響BHLHE40的表達(dá)。BHLHE40表達(dá)越高的臨床樣本或PCa細(xì)胞雷帕霉素IC50值越低，表明這些樣本更容易受到雷帕霉素的影響（圖1D）。雷帕霉素降低PANC-1和BxPC-3細(xì)胞中BHLHE40的表達(dá)水平（圖1E）。先前的研究表明mTOR激活EP300誘導(dǎo)脂肪生成為證實(shí)mTOR-EP300對(duì)BHLHE40表達(dá)的調(diào)控作用，作者進(jìn)一步證明雷帕霉素處理顯著降低PANC-1和BxPC3細(xì)胞中EP300的活化（圖1F）。PCa臨床樣本的IHC染色結(jié)果顯示，BHLHE40在腫瘤樣本中的表達(dá)水平高于癌旁組織（圖1G,H）。在GEO（GSE16515）和TCGA-PAAD數(shù)據(jù)集中觀察到RNA水平的類(lèi)似結(jié)果（圖1I）。在PCa患者中，較高的BHLHE40表達(dá)與總生存期降低顯著相關(guān)（圖1J）。綜上所述，啟動(dòng)子區(qū)染色質(zhì)可及性的增加和mTOR通路活性的增強(qiáng)導(dǎo)致BHLHE40在PCa中表達(dá)的升高，而BHLHE40在PCa中呈不良預(yù)后。

圖1. 胰腺導(dǎo)管腺癌中BHLHE40及其上游調(diào)控因子的鑒定

2. BHLHE40基因下調(diào)可減少腫瘤發(fā)生和胰腺癌的轉(zhuǎn)移

        在兩個(gè)高表達(dá)的細(xì)胞系（PANC-1和BxPC-3）中沉默BHLHE40，并在MIA PaCa-2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)BHLHE40。利用蛋白質(zhì)印跡法（western blot）評(píng)估BHLHE40的敲低和過(guò)表達(dá)（圖2A）。BHLHE40敲低降低細(xì)胞增殖（圖2B）和遷移（圖2C）。皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)表明，BHLHE40沉默細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤顯著小于對(duì)照誘導(dǎo)的腫瘤（圖2D-E）。免疫組織化學(xué)染色顯示，BHLHE40敲低組中Ki-67豐度降低（圖2F）。此外，PET/CT發(fā)光信號(hào)顯示，BHLHE40沉默部分抑制PCa細(xì)胞在肝臟中的轉(zhuǎn)移能力（圖2G,H）。BHLHE40過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了PCa細(xì)胞的體外和體內(nèi)致瘤性（圖2I-K）。同樣，在兩個(gè)已建立的PCa類(lèi)器官（PTO1和PTO2）中，BHLHE40敲低降低細(xì)胞增殖（圖2L-N）。因此，這些數(shù)據(jù)表明BHLHE40具有很強(qiáng)的致癌功能。

圖2. BHLHE40在體內(nèi)外均可促進(jìn)胰腺癌的增殖和肝轉(zhuǎn)移

3. BHLHE40通過(guò)SREBF1調(diào)節(jié)胰腺癌脂肪酸代謝關(guān)鍵因子

        對(duì)BHLHE40沉默的PCa細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析（圖3A）。DEGs富集在脂肪酸代謝的生物過(guò)程中（圖3B）。BHLHE40的ChIP-seq表明，BHLHE40主要與啟動(dòng)子和基因間區(qū)結(jié)合，提示其可能在靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮多重作用（圖3C）。共篩選出187個(gè)基因作為RNA-seq和BHLHE40 ChIP-seq數(shù)據(jù)集的交集組。其中，SREBF1引起興趣（圖3A），因?yàn)樗{(diào)節(jié)參與脂肪酸合成的關(guān)鍵因子，并且在幾種癌癥類(lèi)型中過(guò)表達(dá)BHLHE40。ChIP-seq（圖3D）和熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)（圖3E）的結(jié)果表明，BHLHE40與SREBF1的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合。此外，對(duì)H3K4me3進(jìn)行了ChIP-qPCR，以確認(rèn)SREBF1啟動(dòng)子的激活（圖3F）。

        與其他癌癥類(lèi)型相似，PCa表現(xiàn)出SREBF1的上調(diào)（圖3G）。較高的SREBF1表達(dá)與總生存期降低相關(guān)（圖3H）。正如預(yù)期的那樣，沉默BHLHE40降低PCa細(xì)胞和類(lèi)器官中SREBF1及其下游靶點(diǎn)的表達(dá)（圖3I-J）。免疫熒光（IF）檢測(cè)表明，在來(lái)自PTO1細(xì)胞的惡性導(dǎo)管細(xì)胞中，BHLHE40與SREBF1共定位（圖3K）。綜上所述，BHLHE40調(diào)控SREBF1的轉(zhuǎn)錄，而SREBF1是PCa中脂肪酸代謝的關(guān)鍵因子。

圖3. BHLHE40過(guò)表達(dá)通過(guò)改變胰腺癌細(xì)胞的致癌轉(zhuǎn)錄組促進(jìn)腫瘤的發(fā)生

4. 相分離的BHLHE40凝聚物有助于SREBF1基因座的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子區(qū)域的連接

        在鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中，SREBF1基因座的側(cè)翼有增強(qiáng)子或超級(jí)增強(qiáng)子對(duì)PANC-1細(xì)胞Hi-C測(cè)序數(shù)據(jù)的分析顯示，SREBF1啟動(dòng)子和潛在增強(qiáng)子區(qū)域之間存在一個(gè)染色體內(nèi)環(huán);然而，這一環(huán)在永生化的正常胰腺上皮細(xì)胞系（HPNE）中并不明顯（圖4A）。沉默BHLHE40降低染色質(zhì)的開(kāi)放程度，特別是在BHLHE40結(jié)合的SREBF1的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域（圖4A）。在PANC-1細(xì)胞中，通過(guò)3C檢測(cè)證實(shí)SREBF1增強(qiáng)子和啟動(dòng)子區(qū)域之間存在染色體內(nèi)環(huán)。值得注意的是，該環(huán)在BHLHE40沉默后未檢測(cè)到（圖4B），提示其由BHLHE40介導(dǎo)。此外，BHLHE40沉默降低基因組水平的H3K27ac修飾，尤其是SREBF1基因座上游的H3K27ac修飾，從而進(jìn)一步證實(shí)BHLHE40對(duì)SREBF1轉(zhuǎn)錄的調(diào)控（圖4C）。然而，根據(jù)超級(jí)增強(qiáng)子排序（Rank order of super - enhancer, ROSE）算法預(yù)測(cè)，SREBF1位點(diǎn)上游假定的增強(qiáng)子的17 kb片段被移除（圖4C），因此SREBF1蛋白水平降低，但BHLHE40過(guò)表達(dá)不能完全恢復(fù)（圖4D）。

        免疫共沉淀（Co-IP）證實(shí)BHLHE40與BRD4、MED1和Pol II的相互作用（圖4E）。ChIP-qPCR還表明，這些共激活因子以bhlhe40依賴(lài)的方式與SREBF1的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)結(jié)合（圖4F）。BHLHE40連接啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域，在SREBF1基因座上游形成一個(gè)染色體內(nèi)環(huán)。

        自然紊亂區(qū)域（PONDRs）評(píng)分預(yù)測(cè)因子顯示BHLHE40含有大IDR（177 ~ 319個(gè)氨基酸的片段）（圖5A）。純化重組mEGFP、mEGFP-BHLHE40（全長(zhǎng)，FL）、mEGFP-BHLHE40 （177-319aa）和刪除177-319aa的mEGFP-BHLHE40[稱(chēng)為BHLHE40 （Δ177-319aa）]蛋白。mEGFP-BHLHE40 （177-319aa）以濃度依賴(lài)性方式形成球形液滴（圖5B）。mEGFP-BHLHE40或mEGFP-BHLHE40 （177-319aa）形成的液滴逐漸融合，形成更大更亮的液滴（圖5C）。使用2D培養(yǎng)的PTO1和PTO2細(xì)胞，可以觀察到BHLHE40在細(xì)胞核內(nèi)的點(diǎn)狀分布（圖5D）。通過(guò)測(cè)定光漂白后的熒光回收率（FRAP）來(lái)測(cè)定mEGFP-BHLHE40形成的類(lèi)液態(tài)凝聚物的動(dòng)態(tài)重組和快速交換動(dòng)力學(xué)。光漂白后，mEGFP-BHLHE40點(diǎn)狀體在數(shù)秒內(nèi)恢復(fù)熒光（圖5E-G）。3C檢測(cè)結(jié)果顯示，全長(zhǎng)BHLHE40可以促進(jìn)染色體內(nèi)環(huán)的形成，而BHLHE40 （Δ177- 319aa）則不能（圖4B）。這些結(jié)果表明相分離的BHLHE40凝集物促進(jìn)SREBF1位點(diǎn)增強(qiáng)子和啟動(dòng)子區(qū)域的連接，從而促進(jìn)SREBF1的轉(zhuǎn)錄。

圖4. BHLHE40促進(jìn)SREBF1基因座上游增強(qiáng)子和啟動(dòng)子區(qū)域的連接

圖5. BHLHE40在體內(nèi)外均可形成相分離凝聚體

5. BHLHE40誘導(dǎo)的SREBF1上調(diào)通過(guò)SCD1保護(hù)PCa細(xì)胞免于鐵死亡

        由于BHLHE40和SREBF1導(dǎo)致PCa中脂肪酸代謝的失調(diào)（圖3B,C），因此研究BHLHE40通過(guò)SREBF1在過(guò)氧化作用中的作用。使用BODIPY 581/591 C11探針檢測(cè)氧化脂質(zhì)的流式細(xì)胞術(shù)表明，BHLHE40敲低增加脂質(zhì)過(guò)氧化作用（圖6A）。在BHLHE40敲低的細(xì)胞中，MDA水平也增強(qiáng)（圖6B,C）。此外，BHLHE40或SREBF1敲低的細(xì)胞表現(xiàn)出線粒體萎縮和脂滴增加，這類(lèi)似于RAS-選擇性致死蛋白-3（RSL3）誘導(dǎo)的鐵依賴(lài)性氧化性細(xì)胞死亡（圖6D-F）。鐵死亡抑制劑ferrostatin-1（fer）至少部分消除增強(qiáng)的脂質(zhì)過(guò)氧化作用（圖6A-C），并恢復(fù)BHLHE40敲低導(dǎo)致的細(xì)胞活力下降（圖6G,H）。此外，SREBF1沉默促進(jìn)PCa細(xì)胞中的鐵死亡（圖6I-K）。

        為研究BHLHE40抑制鐵死亡是否需要SREBF1，在BHLHE40敲低的PCa細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SREBF1（圖6L）。SREBF1過(guò)表達(dá)緩解BHLHE40敲低引起的脂質(zhì)過(guò)氧化（圖6M,N）。在PCa臨床樣本中BHLHE40的表達(dá)水平與SREBF1和SCD1的表達(dá)水平相關(guān)（圖6O,P）。因此，BHLHE40主要通過(guò)上調(diào)SREBF1的表達(dá)來(lái)保護(hù)PCa細(xì)胞免于鐵死亡。

圖6. 體內(nèi)BHLHE40缺失可通過(guò)SREBF1促進(jìn)胰腺癌的鐵死亡

6. SREBF1抑制劑（Fatostatin）在BHLHE40高表達(dá)的PCa中表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤療效

        雖然SREBF1抑制劑fatostatin有抑制腫瘤生長(zhǎng)和活性的報(bào)道，但對(duì)PCa細(xì)胞的作用尚未明確。fastostatin處理后PANC-1細(xì)胞活力明顯降低，且呈劑量依賴(lài)性;然而，fastostatin處理后MIA PaCa-2細(xì)胞的活力沒(méi)有觀察到明顯的差異，這可能是由于BHLHE40在MIA PaCa-2細(xì)胞中的低表達(dá)（圖7A）。在患者來(lái)源的類(lèi)器官（圖7B、C）和KPC小鼠細(xì)胞系的體內(nèi)胰腺原位模型（圖7D-H）中觀察到類(lèi)似結(jié)果。此外，IHC染色顯示，與BHLHE40表達(dá)水平較低的細(xì)胞誘導(dǎo)的原位腫瘤相比，BHLHE40表達(dá)水平較高的KPC小鼠細(xì)胞誘導(dǎo)的原位腫瘤的Ki-67表達(dá)水平顯著降低（圖7I）。因此，這些數(shù)據(jù)表明，SREBF1抑制劑對(duì)PCa具有顯著的抗腫瘤作用，這依賴(lài)于BHLHE40的表達(dá)水平。

圖7. SREBF1的特異性抑制劑fatostatin在PCa中發(fā)揮抗腫瘤作用

結(jié)論

        綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)開(kāi)放誘導(dǎo)的BHLHE40表達(dá)在腫瘤中顯著上調(diào)。BHLHE40上調(diào)SREBP的詳細(xì)機(jī)制為PI3K-AKT-mTORC-SREBP信號(hào)軸提供了新的見(jiàn)解。此外，本研究首次揭示了BHLHE40-SREBF1-SCD1-鐵死亡軸在PCa進(jìn)展中的作用，這可能為以脂肪酸合成和去飽和為靶點(diǎn)的PCa治療策略的開(kāi)發(fā)提供線索。

實(shí)驗(yàn)方法

        從胰腺癌手術(shù)樣本中生成類(lèi)器官，細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染，細(xì)胞遷移檢測(cè)，RNA提取及mRNA-Seq文庫(kù)制備，雷帕霉素IC50評(píng)分與BHLHE40基因表達(dá)的Spearman相關(guān)性分析，使用GEPIA分析來(lái)自TCGA和基因型-組織表達(dá)（GTEx）的數(shù)據(jù)，ChIP-seq，CUT&Tag庫(kù)生成和測(cè)序，核分離和ATAC-Seq文庫(kù)制備，Hi-C分析和染色體構(gòu)象捕獲實(shí)驗(yàn)（3C），差異可達(dá)區(qū)域的識(shí)別，免疫沉淀和免疫印跡，RNA分離及實(shí)時(shí)熒光定量PCR，克隆形成實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞增殖和活力測(cè)定，蛋白質(zhì)純化和體外相分離觀察，FRAP實(shí)驗(yàn)，類(lèi)器官細(xì)胞活力測(cè)定，C11-BIDOPY染色，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，MDA測(cè)定，透射電鏡（TEM）成像，動(dòng)物研究（皮下和原位模型），細(xì)胞凋亡檢測(cè)，KPC小鼠衍生細(xì)胞系的構(gòu)建

參考文獻(xiàn)

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