胰腺癌致癌因子—BHLHE40上調(diào)SREBF1抑制癌細(xì)胞鐵死亡

        胰腺癌（PCa）是最致命的人類惡性腫瘤之一。間質(zhì)組織向PCa腫瘤微環(huán)境浸潤的增強(qiáng)限制了惡性上皮細(xì)胞中關(guān)鍵腫瘤特異性轉(zhuǎn)錄因子和表觀基因組異常的鑒定。對胰腺癌類器官的整合轉(zhuǎn)錄組和表觀遺傳多組學(xué)分析表明，堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子40（BHLHE40）在腫瘤樣本中顯著上調(diào)。BHLHE40不僅作為經(jīng)典轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合因子1（SREBF1）的轉(zhuǎn)錄，而且連接SREBF1的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子區(qū)域。BHLHE40-SREBF1-硬脂酰輔酶A去飽和酶軸保護(hù)PCa細(xì)胞免受鐵死亡，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化的積累減少。此外，SREBF1抑制劑fatostatin顯著抑制BHLHE40高表達(dá)的PCa腫瘤的生長。該研究于2023年12月發(fā)表在《Advanced Science》，IF：15.1。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. 胰腺癌患者來源的類器官中BHLHE40位點(diǎn)的開放染色質(zhì)

        使用ATAC-seq和CUT&Tag H3K27ac修飾譜分析兩對腫瘤（PTO1和PTO2）和癌旁（PNO1和PNO2）組織類器官（圖1A）。通過評估TCGA中PAAD數(shù)據(jù)集的mRNA-seq中差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子組的基因的交集，以及PCa類器官中增強(qiáng)的結(jié)合位點(diǎn)的H3K27ac CUT&Tag分析和上調(diào)的可及性增強(qiáng)區(qū)域的ATAC-seq分析確定了一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（BHLHE40），用于進(jìn)一步研究（圖1A）。與PNOs相比，在PCa類器官中，H3K27ac富集于BHLHE40的啟動(dòng)子區(qū)域（圖1B）。EP300沉默或抑制（使用C646作為抑制劑）持續(xù)降低PANC-1和BxPC-3細(xì)胞系中BHLHE40的H3K27ac表達(dá)水平（圖1C）。因此得出結(jié)論，EP300介導(dǎo)的H3K27ac修飾參與BHLHE40的上調(diào)。由于BHLHE40在肝細(xì)胞中的誘導(dǎo)被mTOR信號的抑制劑雷帕霉素所阻止，隨后研究了mTOR信號對BHLHE40的影響BHLHE40的表達(dá)。BHLHE40表達(dá)越高的臨床樣本或PCa細(xì)胞雷帕霉素IC50值越低，表明這些樣本更容易受到雷帕霉素的影響（圖1D）。雷帕霉素降低PANC-1和BxPC-3細(xì)胞中BHLHE40的表達(dá)水平（圖1E）。先前的研究表明mTOR激活EP300誘導(dǎo)脂肪生成為證實(shí)mTOR-EP300對BHLHE40表達(dá)的調(diào)控作用，作者進(jìn)一步證明雷帕霉素處理顯著降低PANC-1和BxPC3細(xì)胞中EP300的活化（圖1F）。PCa臨床樣本的IHC染色結(jié)果顯示，BHLHE40在腫瘤樣本中的表達(dá)水平高于癌旁組織（圖1G,H）。在GEO（GSE16515）和TCGA-PAAD數(shù)據(jù)集中觀察到RNA水平的類似結(jié)果（圖1I）。在PCa患者中，較高的BHLHE40表達(dá)與總生存期降低顯著相關(guān)（圖1J）。綜上所述，啟動(dòng)子區(qū)染色質(zhì)可及性的增加和mTOR通路活性的增強(qiáng)導(dǎo)致BHLHE40在PCa中表達(dá)的升高，而BHLHE40在PCa中呈不良預(yù)后。

圖1. 胰腺導(dǎo)管腺癌中BHLHE40及其上游調(diào)控因子的鑒定

2. BHLHE40基因下調(diào)可減少腫瘤發(fā)生和胰腺癌的轉(zhuǎn)移

        在兩個(gè)高表達(dá)的細(xì)胞系（PANC-1和BxPC-3）中沉默BHLHE40，并在MIA PaCa-2細(xì)胞中過表達(dá)BHLHE40。利用蛋白質(zhì)印跡法（western blot）評估BHLHE40的敲低和過表達(dá)（圖2A）。BHLHE40敲低降低細(xì)胞增殖（圖2B）和遷移（圖2C）。皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)表明，BHLHE40沉默細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤顯著小于對照誘導(dǎo)的腫瘤（圖2D-E）。免疫組織化學(xué)染色顯示，BHLHE40敲低組中Ki-67豐度降低（圖2F）。此外，PET/CT發(fā)光信號顯示，BHLHE40沉默部分抑制PCa細(xì)胞在肝臟中的轉(zhuǎn)移能力（圖2G,H）。BHLHE40過表達(dá)增強(qiáng)了PCa細(xì)胞的體外和體內(nèi)致瘤性（圖2I-K）。同樣，在兩個(gè)已建立的PCa類器官（PTO1和PTO2）中，BHLHE40敲低降低細(xì)胞增殖（圖2L-N）。因此，這些數(shù)據(jù)表明BHLHE40具有很強(qiáng)的致癌功能。

圖2. BHLHE40在體內(nèi)外均可促進(jìn)胰腺癌的增殖和肝轉(zhuǎn)移

3. BHLHE40通過SREBF1調(diào)節(jié)胰腺癌脂肪酸代謝關(guān)鍵因子

        對BHLHE40沉默的PCa細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析（圖3A）。DEGs富集在脂肪酸代謝的生物過程中（圖3B）。BHLHE40的ChIP-seq表明，BHLHE40主要與啟動(dòng)子和基因間區(qū)結(jié)合，提示其可能在靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮多重作用（圖3C）。共篩選出187個(gè)基因作為RNA-seq和BHLHE40 ChIP-seq數(shù)據(jù)集的交集組。其中，SREBF1引起興趣（圖3A），因?yàn)樗{(diào)節(jié)參與脂肪酸合成的關(guān)鍵因子，并且在幾種癌癥類型中過表達(dá)BHLHE40。ChIP-seq（圖3D）和熒光素酶報(bào)告基因檢測（圖3E）的結(jié)果表明，BHLHE40與SREBF1的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合。此外，對H3K4me3進(jìn)行了ChIP-qPCR，以確認(rèn)SREBF1啟動(dòng)子的激活（圖3F）。

        與其他癌癥類型相似，PCa表現(xiàn)出SREBF1的上調(diào)（圖3G）。較高的SREBF1表達(dá)與總生存期降低相關(guān)（圖3H）。正如預(yù)期的那樣，沉默BHLHE40降低PCa細(xì)胞和類器官中SREBF1及其下游靶點(diǎn)的表達(dá)（圖3I-J）。免疫熒光（IF）檢測表明，在來自PTO1細(xì)胞的惡性導(dǎo)管細(xì)胞中，BHLHE40與SREBF1共定位（圖3K）。綜上所述，BHLHE40調(diào)控SREBF1的轉(zhuǎn)錄，而SREBF1是PCa中脂肪酸代謝的關(guān)鍵因子。

圖3. BHLHE40過表達(dá)通過改變胰腺癌細(xì)胞的致癌轉(zhuǎn)錄組促進(jìn)腫瘤的發(fā)生

4. 相分離的BHLHE40凝聚物有助于SREBF1基因座的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子區(qū)域的連接

        在鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中，SREBF1基因座的側(cè)翼有增強(qiáng)子或超級增強(qiáng)子對PANC-1細(xì)胞Hi-C測序數(shù)據(jù)的分析顯示，SREBF1啟動(dòng)子和潛在增強(qiáng)子區(qū)域之間存在一個(gè)染色體內(nèi)環(huán);然而，這一環(huán)在永生化的正常胰腺上皮細(xì)胞系（HPNE）中并不明顯（圖4A）。沉默BHLHE40降低染色質(zhì)的開放程度，特別是在BHLHE40結(jié)合的SREBF1的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域（圖4A）。在PANC-1細(xì)胞中，通過3C檢測證實(shí)SREBF1增強(qiáng)子和啟動(dòng)子區(qū)域之間存在染色體內(nèi)環(huán)。值得注意的是，該環(huán)在BHLHE40沉默后未檢測到（圖4B），提示其由BHLHE40介導(dǎo)。此外，BHLHE40沉默降低基因組水平的H3K27ac修飾，尤其是SREBF1基因座上游的H3K27ac修飾，從而進(jìn)一步證實(shí)BHLHE40對SREBF1轉(zhuǎn)錄的調(diào)控（圖4C）。然而，根據(jù)超級增強(qiáng)子排序（Rank order of super - enhancer, ROSE）算法預(yù)測，SREBF1位點(diǎn)上游假定的增強(qiáng)子的17 kb片段被移除（圖4C），因此SREBF1蛋白水平降低，但BHLHE40過表達(dá)不能完全恢復(fù)（圖4D）。

        免疫共沉淀（Co-IP）證實(shí)BHLHE40與BRD4、MED1和Pol II的相互作用（圖4E）。ChIP-qPCR還表明，這些共激活因子以bhlhe40依賴的方式與SREBF1的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)結(jié)合（圖4F）。BHLHE40連接啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域，在SREBF1基因座上游形成一個(gè)染色體內(nèi)環(huán)。

        自然紊亂區(qū)域（PONDRs）評分預(yù)測因子顯示BHLHE40含有大IDR（177 ~ 319個(gè)氨基酸的片段）（圖5A）。純化重組mEGFP、mEGFP-BHLHE40（全長，FL）、mEGFP-BHLHE40 （177-319aa）和刪除177-319aa的mEGFP-BHLHE40[稱為BHLHE40 （Δ177-319aa）]蛋白。mEGFP-BHLHE40 （177-319aa）以濃度依賴性方式形成球形液滴（圖5B）。mEGFP-BHLHE40或mEGFP-BHLHE40 （177-319aa）形成的液滴逐漸融合，形成更大更亮的液滴（圖5C）。使用2D培養(yǎng)的PTO1和PTO2細(xì)胞，可以觀察到BHLHE40在細(xì)胞核內(nèi)的點(diǎn)狀分布（圖5D）。通過測定光漂白后的熒光回收率（FRAP）來測定mEGFP-BHLHE40形成的類液態(tài)凝聚物的動(dòng)態(tài)重組和快速交換動(dòng)力學(xué)。光漂白后，mEGFP-BHLHE40點(diǎn)狀體在數(shù)秒內(nèi)恢復(fù)熒光（圖5E-G）。3C檢測結(jié)果顯示，全長BHLHE40可以促進(jìn)染色體內(nèi)環(huán)的形成，而BHLHE40 （Δ177- 319aa）則不能（圖4B）。這些結(jié)果表明相分離的BHLHE40凝集物促進(jìn)SREBF1位點(diǎn)增強(qiáng)子和啟動(dòng)子區(qū)域的連接，從而促進(jìn)SREBF1的轉(zhuǎn)錄。

圖4. BHLHE40促進(jìn)SREBF1基因座上游增強(qiáng)子和啟動(dòng)子區(qū)域的連接

圖5. BHLHE40在體內(nèi)外均可形成相分離凝聚體

5. BHLHE40誘導(dǎo)的SREBF1上調(diào)通過SCD1保護(hù)PCa細(xì)胞免于鐵死亡

        由于BHLHE40和SREBF1導(dǎo)致PCa中脂肪酸代謝的失調(diào)（圖3B,C），因此研究BHLHE40通過SREBF1在過氧化作用中的作用。使用BODIPY 581/591 C11探針檢測氧化脂質(zhì)的流式細(xì)胞術(shù)表明，BHLHE40敲低增加脂質(zhì)過氧化作用（圖6A）。在BHLHE40敲低的細(xì)胞中，MDA水平也增強(qiáng)（圖6B,C）。此外，BHLHE40或SREBF1敲低的細(xì)胞表現(xiàn)出線粒體萎縮和脂滴增加，這類似于RAS-選擇性致死蛋白-3（RSL3）誘導(dǎo)的鐵依賴性氧化性細(xì)胞死亡（圖6D-F）。鐵死亡抑制劑ferrostatin-1（fer）至少部分消除增強(qiáng)的脂質(zhì)過氧化作用（圖6A-C），并恢復(fù)BHLHE40敲低導(dǎo)致的細(xì)胞活力下降（圖6G,H）。此外，SREBF1沉默促進(jìn)PCa細(xì)胞中的鐵死亡（圖6I-K）。

        為研究BHLHE40抑制鐵死亡是否需要SREBF1，在BHLHE40敲低的PCa細(xì)胞中過表達(dá)SREBF1（圖6L）。SREBF1過表達(dá)緩解BHLHE40敲低引起的脂質(zhì)過氧化（圖6M,N）。在PCa臨床樣本中BHLHE40的表達(dá)水平與SREBF1和SCD1的表達(dá)水平相關(guān)（圖6O,P）。因此，BHLHE40主要通過上調(diào)SREBF1的表達(dá)來保護(hù)PCa細(xì)胞免于鐵死亡。

圖6. 體內(nèi)BHLHE40缺失可通過SREBF1促進(jìn)胰腺癌的鐵死亡

6. SREBF1抑制劑（Fatostatin）在BHLHE40高表達(dá)的PCa中表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤療效

        雖然SREBF1抑制劑fatostatin有抑制腫瘤生長和活性的報(bào)道，但對PCa細(xì)胞的作用尚未明確。fastostatin處理后PANC-1細(xì)胞活力明顯降低，且呈劑量依賴性;然而，fastostatin處理后MIA PaCa-2細(xì)胞的活力沒有觀察到明顯的差異，這可能是由于BHLHE40在MIA PaCa-2細(xì)胞中的低表達(dá)（圖7A）。在患者來源的類器官（圖7B、C）和KPC小鼠細(xì)胞系的體內(nèi)胰腺原位模型（圖7D-H）中觀察到類似結(jié)果。此外，IHC染色顯示，與BHLHE40表達(dá)水平較低的細(xì)胞誘導(dǎo)的原位腫瘤相比，BHLHE40表達(dá)水平較高的KPC小鼠細(xì)胞誘導(dǎo)的原位腫瘤的Ki-67表達(dá)水平顯著降低（圖7I）。因此，這些數(shù)據(jù)表明，SREBF1抑制劑對PCa具有顯著的抗腫瘤作用，這依賴于BHLHE40的表達(dá)水平。

圖7. SREBF1的特異性抑制劑fatostatin在PCa中發(fā)揮抗腫瘤作用

結(jié)論

        綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)開放誘導(dǎo)的BHLHE40表達(dá)在腫瘤中顯著上調(diào)。BHLHE40上調(diào)SREBP的詳細(xì)機(jī)制為PI3K-AKT-mTORC-SREBP信號軸提供了新的見解。此外，本研究首次揭示了BHLHE40-SREBF1-SCD1-鐵死亡軸在PCa進(jìn)展中的作用，這可能為以脂肪酸合成和去飽和為靶點(diǎn)的PCa治療策略的開發(fā)提供線索。

實(shí)驗(yàn)方法

        從胰腺癌手術(shù)樣本中生成類器官，細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染，細(xì)胞遷移檢測，RNA提取及mRNA-Seq文庫制備，雷帕霉素IC50評分與BHLHE40基因表達(dá)的Spearman相關(guān)性分析，使用GEPIA分析來自TCGA和基因型-組織表達(dá)（GTEx）的數(shù)據(jù)，ChIP-seq，CUT&Tag庫生成和測序，核分離和ATAC-Seq文庫制備，Hi-C分析和染色體構(gòu)象捕獲實(shí)驗(yàn)（3C），差異可達(dá)區(qū)域的識別，免疫沉淀和免疫印跡，RNA分離及實(shí)時(shí)熒光定量PCR，克隆形成實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞增殖和活力測定，蛋白質(zhì)純化和體外相分離觀察，FRAP實(shí)驗(yàn)，類器官細(xì)胞活力測定，C11-BIDOPY染色，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測，MDA測定，透射電鏡（TEM）成像，動(dòng)物研究（皮下和原位模型），細(xì)胞凋亡檢測，KPC小鼠衍生細(xì)胞系的構(gòu)建

參考文獻(xiàn)

        Cao Y, Wang X, Liu Y, Liu P, Qin J, Zhu Y, Zhai S, Jiang Y, Liu Y, Han L, Luo J, Zhang R, Shi M, Wang L, Tang X, Xue M, Liu J, Wang W, Wen C, Deng X, Peng C, Chen H, Cheng D, Jiang L, Shen B. BHLHE40 Inhibits Ferroptosis in Pancreatic Cancer Cells via Upregulating SREBF1. Adv Sci (Weinh). 2023 Dec 8:e2306298. doi: 10.1002/advs.202306298. Epub ahead of print. PMID: 38064101.