磁迷走神經(jīng)刺激通過抑制焦亡減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷

         心肌缺血再灌注(I/R)損傷伴隨著心臟自主神經(jīng)系統(tǒng)失衡，表現(xiàn)為交感神經(jīng)張力過度激活和迷走神經(jīng)活性降低。在我們之前的研究中，我們率先開發(fā)了磁迷走神經(jīng)刺激(mVNS)系統(tǒng)。該系統(tǒng)能精確刺激迷走神經(jīng)，對心肌梗死具有顯著的療效和安全性。然而，mVNS是否可以減輕心肌I/R損傷及其具體的潛在機制仍不確定。本研究采用大鼠心肌I/R損傷模型，探討mVNS對這類損傷的治療潛力。我們的研究結果顯示，mVNS治療導致心肌梗死面積減少，心室顫動(VF)發(fā)生率降低，炎癥細胞因子釋放抑制。從機制上講，mVNS通過M2AChR/OGDHL/ROS軸抑制NLRP3介導的心肌焦亡，對心肌I/R損傷有有益作用?？偟膩碚f，這些結果突出了mVNS作為心肌I/R損傷治療策略的潛力。本文于2023年11月發(fā)表于“Journal of Nanobiotechnology”（IF=10.2）上。

技術路線

結果：

1）磁刺激系統(tǒng)和磁迷走神經(jīng)刺激的建立

         我們成功合成了SPIOCS/GP溫度敏感水凝膠(圖1A)。在動物實驗中，我們首先分離SD大鼠右側迷走神經(jīng)，然后將SPIO-CS/GP水凝膠涂覆在迷走神經(jīng)表面，一旦錐體磁鐵經(jīng)過，對右側迷走神經(jīng)進行磁刺激(圖1B)。圖1C顯示了mVNS治療心肌I/R損傷的示意圖(圖1C)。

2）mVNS治療可減輕心肌I/R損傷、心室顫動和炎性細胞因子釋放

         與I/R組相比，mVNS明顯減少了心臟梗死面積，改善了心功能(圖2A和B)，而mVNS治療顯著降低了I/R損傷引起的血清心肌酶濃度升高(圖2C)。采用I/R致室性心律失常模型評估mVNS治療的抗心律失常效果。再灌注結束時，在程序電刺激后收集心電圖數(shù)據(jù)(圖2D)。我們發(fā)現(xiàn)mVNS可以顯著降低I/R誘導的VF的發(fā)生率和持續(xù)時間(圖2E, F)。結果還顯示，與假手術組相比，I/R損傷顯著增加了心率，而mVNS明顯降低I/R損傷引起的高心率(圖2G)。此外，與假手術組相比，I/R大鼠心肌炎癥細胞浸潤和IL-6表達均顯著升高。然而，mVNS治療減輕了心肌中炎癥細胞浸潤和IL-6的表達(圖2H)。血清中IL-6、TNF-α的表達也出現(xiàn)類似變化。mVNS可逆轉I/R誘導的血清IL-6和TNF-α濃度升高(圖2I)。

3）mVNS可減輕心肌I/R損傷所致的心肌焦亡

         我們測量了心肌中Tunel陽性心肌細胞。結果顯示，與I/R組相比，mVSN治療有效緩解了Tunel陽性心肌細胞(圖3A)。隨后，我們評估了I/R損傷大鼠心肌組織內的焦亡指標。值得注意的是，與假手術組相比，I/R組NLRP3心肌表達明顯升高(圖3B-D)。心肌中Cleaved caspase-1和Cleaved N端GSDMD表達升高(圖3C和D)，I/R組大量炎癥因子(IL-1β和IL-18)釋放(圖3E)。然而，mVNS治療后心肌組織內的焦亡相關蛋白水平和炎癥因子的釋放均有所減輕(圖3B-E)。提示mVNS具有抑制I/R誘導的焦亡的能力。

4）mVNS通過抑制OGDHL表達和改善線粒體損傷來調節(jié)心肌焦亡

         我們初步證實，心肌I/R損傷時OGDHL的表達和活性顯著升高，而mVNS可以逆轉OGDHL的表達和活性上調(圖4A)。為了驗證OGDHL在mVNS減輕心肌焦亡中的作用，我們使用AAV9-cTNT-OGDHL在心肌中過表達OGDHL的表達。Western blot結果顯示，病毒轉染心肌后，OGDHL的表達明顯升高(圖4B)。Evans Blue/TTC雙染色顯示，OGDHL過表達減弱了mVNS減小心肌梗死大小的作用(圖4C)。超聲心動圖顯示OGDHL過表達削弱了mVNS對心功能的改善(圖4D)。同樣，提高OGDHL的表達水平也會阻礙mVNS減輕心肌焦亡和炎癥細胞因子釋放的能力(圖4F-4H)。我們進一步檢測了心肌組織的線粒體，發(fā)現(xiàn)mVNS顯著改善心肌I/R損傷引起的線粒體結構損傷和mtROS的產(chǎn)生。然而，OGDHL過表達阻礙了mVNS介導的線粒體損傷改善和心肌中mtROS的產(chǎn)生(圖4I, J)。

5）ACh通過逆轉OGDHL表達升高和減輕線粒體損傷來減少焦亡

         首先，我們證實了體外H/R模型誘導焦亡的有效性和ACh的有效性(圖5A)。我們通過OGD和再氧化驗證了OGDHL表達和活性的升高，而ACh被發(fā)現(xiàn)可以逆轉NRCM中OGDHL和活性的上調(圖5B)。為了證實OGDHL參與了ACh對焦亡的緩解作用，我們利用Ad-OGDHL上調了NRCM中OGDHL的表達。Western blot分析顯示，轉染Ad-OGDHL后，NRCM中OGDHL的表達顯著增加(圖5C)。如圖5D所示，ACh處理逆轉了H/R存在下裂解的GSDMD-N從細胞質溶質到質膜的移位，而OGDHL過表達減弱了ACh對裂解的GSDMD-N移位的影響(圖5D)。此外，我們的研究表明，NRCM中OGDHL的過表達抑制了ACh在減輕焦亡相關蛋白表達方面的有益作用(圖5E, F)。此外，我們評估了NRCM的mtROS和線粒體功能。結果表明，OGD和再氧化導致大量mtROS的產(chǎn)生和顯著的線粒體損傷，ACh處理抑制ROS的產(chǎn)生，改善線粒體結構，增強ATP的產(chǎn)生。而OGDHL過表達則阻礙了ACh介導的NRCM線粒體損傷和mtROS產(chǎn)生的改善(圖5G-5I)。

6）mVNS激活M2AChR抑制體內OGDHL的表達和焦亡

         為了進一步研究M2AChR是否參與mVNS的抗焦亡作用，我們利用M2AChR拮抗劑Otenzepad抑制M2AChR的激活。結果顯示，M2AChR拮抗劑Otenzepad減弱了mVNS減小心肌梗死大小和改善心功能的作用(圖6A和B)。進一步的研究表明，mVNS的抗焦亡作用也通過抑制M2AChR的活性而受到抑制(圖6D-F)。同樣，我們還觀察到M2AChR拮抗劑Otenzepad促進OGDHL表達，隨后導致心臟組織中ROS產(chǎn)生的增加(圖6E和G)。

7）ACh激活M2AChR抑制OGDHL的表達和活性以對抗焦亡

         我們還評估了M2AChR拮抗劑Otenzepad對ACh體外抑制作用的影響。結果顯示，Otenzepad減弱了ACh對抑制OGDHL表達水平的影響(圖7A)。mtROS熒光染色顯示，M2AChR拮抗劑Otenzepad降低了ACh抑制過量mtROS生成的作用(圖7B)。正如預期的那樣，M2AChR拮抗劑Otenzepad也抑制了ACh抑制NRCM中裂解的GSDMD-N易位的作用(圖7C)。

結論：

         mVNS治療通過M2AChR/OGDHL/ROS軸抑制心肌焦亡，從而減輕心肌I/R損傷。我們的研究結果強調了mVNS對心肌I/R損傷的治療潛力，具有重要的臨床轉化價值。

實驗方法：

         動物心肌I/R模型，SPIO-CS/GP水凝膠注射和磁迷走神經(jīng)刺激，梗死面積測定，心功能評估，程控電刺激，心率變異性(HRV)分析，免疫組織化學染色，Elisa檢測，Tunel染色，心肌超微結構檢查，AAV9-cTNT-OGDHL治療，細胞培養(yǎng)和處理，ATP測定，免疫熒光，腺病毒構建與細胞感染，免疫印跡分析

參考文獻：

         Lu Y, Chen K, Zhao W, Hua Y, Bao S, Zhang J, Wu T, Ge G, Yu Y, Sun J, Zhang F. Magnetic vagus nerve stimulation alleviates myocardial ischemia-reperfusion injury by the inhibition of pyroptosis through the M2AChR/OGDHL/ROS axis in rats. J Nanobiotechnology. 2023 Nov 14;21(1):421. doi: 10.1186/s12951-023-02189-3.