膽汁外泌體miR-182183-5p靶向HPGD促進(jìn)膽管癌惡化

膽管癌（Colangiocarcinoma，CCA）是一種起源于膽管的高度致命的惡性腫瘤。目前的 CCA 診斷和預(yù)后評(píng)估無法滿足臨床需求。膽汁檢測(cè)很少進(jìn)行，在此，作者旨在通過評(píng)估膽汁外泌體的濃度和成分來估計(jì)膽汁液體活檢的臨床意義。CCA 細(xì)胞將外泌體miR-182/183-5p 分泌到膽汁中，而miR-182/183-5p 可靶向 CCA 細(xì)胞和 MCs 中的羥基前列腺素脫氫酶，增加前列腺素 E2和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A 的釋放。前列腺素 E2 通過激活 PTGER1促進(jìn)干性。該研究于2024年2月發(fā)表在《Hepatology》，IF：13.5。

技術(shù)路線：

主要研究結(jié)果：

1. 膽汁外泌體miR-182-5p和miR-183-5p是CCA的生物標(biāo)志物

從44例膽總管結(jié)石（CBDS）患者、6例胰腺癌患者和121例CCA患者的膽汁和血清中，采用超速離心法提取外泌體，并通過透射電鏡、生物標(biāo)志物檢測(cè)、納米顆粒跟蹤分析和NanoFCM進(jìn)行鑒定(圖1A)。有趣的是，CBDS、PDAC和CCA患者的膽汁外泌體（Exo）濃度沒有顯著差異，但CCA患者的血清Exo明顯多于其他患者(圖1B)。此外，根據(jù)Exo濃度將隊(duì)列分為Exohigh和Exolow亞群，膽汁Exo濃度是比血清Exo濃度敏感得多的生物標(biāo)志物(圖1C)。提取膽汁或血清外泌體，孵育CCA細(xì)胞。有趣的是，膽汁而非血清Exos顯著促進(jìn)CCA細(xì)胞增殖和侵襲(圖1D)。利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜和miRNA-seq技術(shù)研究CCA和CBDS的膽汁Exos的含量)。在pCCAs/dCCAs的miRNA-seq中，癌旁組織、CCA膽汁和血清Exos共有3個(gè)上調(diào)的miRNA，分別為miR-182-5p、miR-183-5p和miR-221-3p(圖1E)。有趣的是，miR-182-5p和miR183-5p屬于同一個(gè)miRNA簇。在CCA血清Exo miRNA-seq的多個(gè)數(shù)據(jù)集中驗(yàn)證miR-182- 5p和miR-183-5p的上調(diào)，而不是miR-221-3p的上調(diào)(圖1E)。檢測(cè)CCA、PDAC、CBDS、HCC、原發(fā)性硬化性膽管炎和膽總管囊腫的膽汁和血清中的外泌體miR-182/183-5p，表明外泌體miR-182/183-5p的顯著增加在CCA中是特異性的(圖1F)。

圖1. 外泌體miR-182-5p和miR-183-5p在CCA膽汁中上調(diào)

2. 膽汁外泌體miR-182-5p和miR-183-5p參與Exo誘導(dǎo)的CCA進(jìn)展

通過將miR-182/183-5p模擬物電轉(zhuǎn)染到CBDS膽汁的Exos中來制備人工過表達(dá)miR-182/183-5p的Exos，通過將miRNA抑制劑電轉(zhuǎn)染到CCA膽汁的Exos中來制備miR-182/183-5p沉默的Exos (圖2A)。使用經(jīng)過改造的Exos孵育CCA細(xì)胞，結(jié)果表明，miR-182/183-5p過表達(dá)增加了膽汁Exos誘導(dǎo)的增殖、侵襲和EMT，而miR-182/183-5p抑制劑減弱了其誘導(dǎo)的增殖、侵襲和EMT(圖2B-D)。利用QBC-939細(xì)胞建立異種移植瘤模型，瘤內(nèi)注射過表達(dá)或沉默mir-182/183-5p的Exos。CCBDS-膽汁Exos對(duì)腫瘤生長(zhǎng)無顯著影響，但如果將這些Exos轉(zhuǎn)染miR-182/183-5p模擬物，則腫瘤體積和重量顯著增加(圖2E)。這些實(shí)驗(yàn)表明，miR-182/183-5p是膽汁Exos誘導(dǎo)的CCA進(jìn)展的重要參與者。

臨床上，根據(jù)膽汁/血清外泌體miR-182/183-5p水平將患者分為miR-182/183-5phigh和miR-182/183-5plow亞群，并提示膽汁外泌體miR-182/183-5p與血清Exo中的miR-182/183-5p相比是更敏感的預(yù)后生物標(biāo)志物(圖2F)。

圖2. 膽汁外泌體miR-182-5p和miR-183-5p參與外泌體誘導(dǎo)的CCA進(jìn)展

3. 含有miR-182/183-5p的外泌體由CCA衍生并通過自分泌途徑促進(jìn)疾病進(jìn)展

為了研究含miR-182/183-5p的Exos的來源，使用透射電子顯微鏡和nanoFCM從CCA細(xì)胞系中提取并鑒定Exos(圖3A)。使用PKH26標(biāo)記的CCA膽汁Exos或轉(zhuǎn)染cy3標(biāo)記的miR-182-5p和FAM標(biāo)記的miR-183-5p的CCA膽汁Exos孵養(yǎng)類器官或CCA細(xì)胞，表明膽汁Exos和CCA來源的miR182/183-5p均可被類器官和細(xì)胞吸收(圖3B和C)。將PHK26標(biāo)記的膽汁Exos或電轉(zhuǎn)染cy3-miR-182- 5p/FAM-miR-183-5p的膽汁Exos注射到皮下CCA異種移植物中。PKH26標(biāo)記的膽汁Exos可以在CCA組織中廣泛觀察到(圖3D)。裸miR182/183-5p不能被CCA腫瘤吸收，但外泌體miR-182/183-5p能夠被異種移植物吸收(圖3D)，提示miR-182/183-5p可以通過外泌體的方式被CCA組織吸收。此外，將負(fù)載cy3/ FAM標(biāo)記的miR182/183-5p的膽汁Exos注射到小鼠膽囊中，建立原位模型，并檢測(cè)膽管上皮對(duì)miRNA的攝取。與圖3D的結(jié)果一致，膽管上皮細(xì)胞可獲取外泌體miR-182/183-5p，但不能獲取裸miRNA(圖3E)。所有結(jié)果表明，miR-182/183-5p可從CCA細(xì)胞釋放并被其他CCA細(xì)胞或上皮細(xì)胞吸收。此外，與對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)基相比，miR-182/183-5p過表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)基中的Exos廣泛促進(jìn)了CCA的增殖、侵襲和EMT(圖3F)。

圖3.CCA來源的miR-182/183-5p可通過外泌體方式被CCA細(xì)胞吸收

4. 細(xì)胞內(nèi)miR-182/183-5p促進(jìn)CCA增殖、侵襲和EMT

在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR182/183-5p模擬物或抑制劑或穩(wěn)定過表達(dá)miR-182/183-5p的CCA細(xì)胞中，過表達(dá)miR-182/183-5p時(shí)觀察到促進(jìn)了增殖、遷移、侵襲和EMT，而沉默miR-182/183-5p時(shí)則發(fā)生了相反的作用(圖4A-C)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，使用對(duì)照細(xì)胞或穩(wěn)定的miR-182/183-5過表達(dá)QBC-939的皮下異種移植也表明，miR-182/183-5p促進(jìn)CCA生長(zhǎng)(圖4D)。通過尾靜脈注射穩(wěn)定過表達(dá)miR-182/183-5p的QBC-939細(xì)胞建立轉(zhuǎn)移模型，提示miR-182/183-5p過表達(dá)促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移(圖4E)。以上結(jié)果表明，細(xì)胞內(nèi)miR-182/183-5p可促進(jìn)CCA進(jìn)展。

5. 膽管癌組織和膽汁Exos中miR-182/183-5p與膽管癌預(yù)后相關(guān)

通過原位雜交發(fā)現(xiàn)miR-182/183-5p在CCA中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，并且CCA組織中的miR-182/183-5p表達(dá)與膽汁和血清的外泌體miR-182/183-5p顯著相關(guān)(圖4F)。以CCA miR182/183-5p為界值，將患者分為CCA miR182/183-5p低表達(dá)組和CCA miR182/183-5p高表達(dá)組。CCA組織中高miR-182/183-5p與所有CCA亞型的不良預(yù)后顯著相關(guān)(圖4F)。 

圖4. 細(xì)胞內(nèi)miR-182/183-5p促進(jìn)CCA的進(jìn)展，并與CCA的預(yù)后相關(guān)

6.HPGD是miR-182/183-5p的靶基因，在膽管癌中通過升高前列腺素E2促進(jìn)腫瘤干性

miR-182/183-5p過表達(dá)QBC939的mRNA-seq篩選miR-182/183-5p的靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-182-5p和miR-183-5p共同下調(diào)的基因有127個(gè)(GSE:214159)。結(jié)合miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)(miRPathDB和miRWalk)預(yù)測(cè)的2606個(gè)靶基因，進(jìn)一步篩選出5個(gè)基因作為miR-182/183-5p的候選靶基因，分別為TIGAR、AKR1CA、HPGD、SH3BP5和KLHL8，其中HPGD被實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證為下調(diào)最明顯的基因(圖5A)。在CCA細(xì)胞中，miR-182/183-5p模擬物顯著降低HPGD的表達(dá)(圖5A)，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步鑒定HPGD mRNA 3'UTR的miR-182/183-5p結(jié)合序列(圖5B)。在CCA細(xì)胞中，過表達(dá)miR-182/183- 5p或HPGD抑制劑SW022391增加了細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)基中的PGE2(圖5C)。更有趣的是，CCA膽汁中的PGE2顯著高于CBDS膽汁中的PGE2，但血清中的PGE2沒有顯著差異(圖5C)。PGE2濃度與膽汁外泌體miR-182/183-5p呈正相關(guān)，但與血清外泌體miR-182/183-5p無相關(guān)性(圖5D)。通過時(shí)序檢驗(yàn)進(jìn)一步確定HPGD是CCA預(yù)后良好的生物標(biāo)志物(圖5E)。COX1/2是PGE2生成的關(guān)鍵酶，使用HPGD抑制劑SW033291和COX1/2抑制劑氯諾昔康處理miR-182/183-5p過表達(dá)/沉默和HPGD過表達(dá)/沉默細(xì)胞，以驗(yàn)證HPGD是否為miR-182/183-5p誘導(dǎo)的疾病進(jìn)展的責(zé)任基因。敲低HPGD后細(xì)胞增殖和侵襲能力增強(qiáng)，而過表達(dá)HPGD后細(xì)胞增殖和侵襲能力減弱。此外，miR-182/183-5誘導(dǎo)的CCA進(jìn)程被SW033291增強(qiáng)，而被氯諾昔康減弱。外源性二甲基pge2 (dmPGE2)在一定程度上恢復(fù)HPGD過表達(dá)引起的抑制(圖5F)。這些結(jié)果表明HPGD在miR-182/183-5p誘導(dǎo)的CCA進(jìn)展中是必需的。外源性PGE2挽救HPGD過表達(dá)和miR-182/183-5p抑制劑引起的腫瘤抑制作用(圖5F)。上述結(jié)果表明，miR-182/183-5p通過抑制HPGD的表達(dá)促進(jìn)CCA的干性，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，從而產(chǎn)生更多的PGE2。。

圖5. miR-182/183-5p通過靶向HPGD并上調(diào)PGE2促進(jìn)腫瘤干性

7. miR-182/183-5p-HPGD軸通過促進(jìn)肥大細(xì)胞釋放VEGF-A來促進(jìn)血管生成

對(duì)8例肝外膽管癌和3例癌旁組織進(jìn)行單細(xì)胞mRNA-seq (GSE:213452)，并將數(shù)據(jù)與之前發(fā)表的iCCA單細(xì)胞mRNA數(shù)據(jù)(GSE:138709)整合。在整合的數(shù)據(jù)中，肥大細(xì)胞(MC)的HPGD表達(dá)明顯高于其他細(xì)胞類型(圖6A)，因此進(jìn)一步評(píng)估HPGD在MC中的功能。PKH26標(biāo)記的膽汁外泌體和Cy3/ FAM標(biāo)記的CCA細(xì)胞來源的外泌體均與MC細(xì)胞系LAD2孵育。與CCA細(xì)胞一樣，LAD2可以吸收膽道或CCA來源的外泌體miR182/183-5p(圖6B)。應(yīng)用Olink蛋白質(zhì)組學(xué)(Immuno-Oncology panel)和非標(biāo)記質(zhì)譜技術(shù)篩選miR182/183-5p是否促進(jìn)MCs釋放其他腫瘤相關(guān)因子。在Olink中，VEGF-A是在HPGD沉默的MCs培養(yǎng)基和mir -182/183-5p過表達(dá)的MCs培養(yǎng)基中上調(diào)最顯著的蛋白(圖6C )。在label-free質(zhì)譜分析中，25種蛋白質(zhì)在miR-182/183-5p過表達(dá)和HPGD沉默的MC培養(yǎng)基中同時(shí)增加，VEGF-A是已知的唯一從MC釋放的蛋白質(zhì)(圖6D)。VEGF-A是眾所周知的血管生成因子，因此進(jìn)一步用管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CCA的血管生成。過表達(dá)miR-182/183-5p或沉默HPGD-LAD2的條件培養(yǎng)基分別與VEGF-A中和抗體Bevacizumab孵育人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)。貝伐珠單抗顯著阻斷由miR-182/183-5p過表達(dá)或HPGD沉默的LAD2條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的血管生成(圖6E)。

此外，在HSC-NOGEXL小鼠中建立pCCA PDXs來模擬CCA腫瘤微環(huán)境(TME)，并注射Figure 2A所示的Exos。將貝伐單抗、氯諾昔康或載氯諾昔康的水凝膠注射到腫瘤內(nèi)。貝伐珠單抗和氯諾昔康可廣泛抑制腫瘤生長(zhǎng)，而攜帶氯諾昔康的水凝膠由于氯諾昔康持續(xù)釋放，因此具有更強(qiáng)的腫瘤抑制作用(圖6F)。作為血管生成的指標(biāo)，注射miR-182/183- 5p過表達(dá)的CBDS-Exo后，PDXs中的MVD增加，如果給予貝伐珠單抗或氯諾昔康，則減少(圖6G)。上述結(jié)果表明，miR182/183-5p可通過誘導(dǎo)MC分泌PGE2和VEGF-A促進(jìn)CCA進(jìn)展。

圖6. MC中miR-182/183-5p-HPGD軸通過重塑CCA微環(huán)境促進(jìn)血管生成

8.PGE2通過激活PTGER1促進(jìn)CCA干性

TGER1的表達(dá)主要在CCA組織和細(xì)胞系中，而PTGER4的表達(dá)主要在癌旁組織中(圖7A和B)。通過分別沉默PTGER1-4，我們發(fā)現(xiàn)PTGER1敲低顯著降低了dmPGE2誘導(dǎo)的干性，因此減弱了CCA的增殖和侵襲(圖7C)。此外，miR-182/183-5p過表達(dá)或HPGD敲低對(duì)CCA干性、增殖和侵襲的促進(jìn)作用可被PTGER1敲低所阻斷，表明在miR-182/183-5p-HPGD-PGE2軸參與的CCA進(jìn)展中，PTGER1是必需的(圖7D)。通過Bret實(shí)驗(yàn)，證明在QBC-939細(xì)胞中PTGER1與Gαq偶聯(lián)(圖7E)。此外，用dmPGE2和Gαq拮抗劑YM-254890處理ptger1沉默的QBC-939細(xì)胞，檢測(cè)到Gαq-PLC-PKC信號(hào)通路下游生物標(biāo)志物MARCKS的磷酸化，進(jìn)一步提示CCA細(xì)胞中PGE2偶聯(lián)PTGER1-Gαq-PLC-PKC信號(hào)通路(圖7F)。

PGE2通過激活PTGER1促進(jìn)CCA干性

結(jié)論

綜上所述，本研究通過體外/體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和患者來源的異種移植(PDX)實(shí)驗(yàn)，確定miR-182/183-5p的靶基因，并闡明了外泌體miR-182/183-5p誘導(dǎo)CCA進(jìn)展的機(jī)制，揭示了一種依賴于膽汁外泌體 miR-182/183-5p 和 MCs 的CCA自我驅(qū)動(dòng)進(jìn)展類型，這是 CCA 與膽汁相互作用的一種新模式。

實(shí)驗(yàn)方法：

膽汁和血清的獲取，外泌體分離，移植瘤模型構(gòu)建，細(xì)胞培養(yǎng)和處理，細(xì)胞轉(zhuǎn)染，原位雜交，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，時(shí)序檢驗(yàn)，單細(xì)胞mRNA-seq，質(zhì)譜分析，管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，Bret實(shí)驗(yàn)，RT-PCR和qRT-PCR

參考文獻(xiàn)

Shu L, Li X, Liu Z, Li K, Shi A, Tang Y, Zhao L, Huang L, Zhang Z, Zhang D, Huang S, Lian S, Sheng G, Yan Z, Zhang Z, Xu Y. Bile exosomal miR-182/183-5p increases cholangiocarcinoma stemness and progression by targeting HPGD and increasing PGE2 generation. Hepatology. 2024 Feb 1;79(2):307-322. doi: 10.1097/HEP.0000000000000437. Epub 2023 May 5. PMID: 37140231.