Mic19耗竭會(huì)損害內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸和線粒體脂質(zhì)代謝，并引發(fā)肝病

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）與線粒體接觸對(duì)于調(diào)節(jié)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、合成和代謝至關(guān)重要。然而，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體接觸的分子機(jī)制和生理功能仍不清楚。研究人員發(fā)現(xiàn)MICOS（線粒體接觸位點(diǎn)和嵴組織系統(tǒng)）復(fù)合物的一個(gè)關(guān)鍵亞基Mic19通過(guò)EMC2-SLC25A46-Mic19軸調(diào)控ER-線粒體接觸。Mic19肝臟特異性敲除（LKO）會(huì)導(dǎo)致小鼠肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體接觸減少、線粒體脂質(zhì)代謝紊亂、線粒體嵴紊亂和線粒體未折疊蛋白應(yīng)激反應(yīng)，損害肝臟線粒體脂肪酸β氧化和脂質(zhì)代謝，從而可能自發(fā)引起小鼠非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和肝纖維化。然而，Mic19 LKO肝細(xì)胞中Mic19的重新表達(dá)可阻斷小鼠肝病的發(fā)展。此外，Mic19過(guò)表達(dá)還能抑制MCD誘導(dǎo)的脂肪肝。因此，作者的研究結(jié)果揭示了EMC2-SLC25A46-Mic19軸是調(diào)節(jié)ER-線粒體接觸的途徑，并揭示了ER-線粒體接觸受損可能是與NASH和肝纖維化發(fā)展相關(guān)的機(jī)制。本文于2024年1月發(fā)表在《Nature Communications》，IF：16.6。

技術(shù)路線

主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1.Mic19參與調(diào)節(jié)ER-線粒體接觸

線粒體可與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）接觸，以調(diào)節(jié)重要的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)功能。MAMs是ER和線粒體之間的物理聯(lián)系，對(duì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。Monteiro-Cardoso等人最近報(bào)道，脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白ORP5和ORP8主要位于MAM亞結(jié)構(gòu)域，并與MICOS復(fù)合物物理連接。Mic19是MICOS復(fù)合物的一個(gè)關(guān)鍵亞基，對(duì)MICOS和SAM復(fù)合物的完整性至關(guān)重要。作者隨后研究了Mic19在線粒體-ER接觸中的作用。HIS-SIM分析顯示，在Mic19敲除（KD）或敲除（KO）的HeLa或COS7細(xì)胞中，ER和線粒體的共定位減少（圖1a-d）。此外，透射電子顯微鏡（TEM）分析表明，Mic19 KO導(dǎo)致線粒體超微結(jié)構(gòu)異常，包括線粒體嵴連接（CJs）缺失和線粒體嵴排列改變，但線粒體長(zhǎng)度沒(méi)有變化（圖1e-g）。此外，Mic19KO導(dǎo)致ER與線粒體之間的距離顯著增加，并導(dǎo)致ER-線粒體接觸數(shù)量減少（圖1h,i），表明Mic19耗竭會(huì)減少ER-線粒體接觸。此外，作者還研究了Mic19耗竭對(duì)線粒體數(shù)量和含量的影響，這可能會(huì)損害ER-線粒體接觸。HIS-SIM成像和Western blotting（WB）分析表明，線粒體數(shù)量和含量（線粒體標(biāo)記蛋白，包括Tom20、Tom40、Tim23、SDHA和Cox4）在Mic19KO細(xì)胞中沒(méi)有變化。此外，mito-keima檢測(cè)顯示，與對(duì)照細(xì)胞相比，Mic19 KO細(xì)胞的線粒體自噬沒(méi)有發(fā)生變化。因此，這些結(jié)果表明，Mic19參與了ER-線粒體接觸的調(diào)控。

圖一：Mic19耗竭減少ER-線粒體接觸。

2.Mic19通過(guò)EMC2-SLC25A46-Mic19軸調(diào)節(jié)ER-線粒體接觸

線粒體外膜蛋白SLC25A46與MICOS復(fù)合物相互作用，并通過(guò)EMC235維持與ER的相互作用。因此，作者研究了Mic19調(diào)控的ER與線粒體之間的串?dāng)_是否與SLC25A46有關(guān)。使用抗Flag或抗SLC25A46抗體進(jìn)行免疫共沉淀（co-IP）分析表明，Flag-SLC25A46偶聯(lián)珠或SLC25A46偶聯(lián)珠能沉淀Mic19、Mic60和EMC2，而對(duì)照珠不能，表明SLC25A46能與Mic19、Mic60和EMC2相互作用（圖2a,b）。此外，Mic19 KO會(huì)降低細(xì)胞中SLC25A46的蛋白水平（圖2c,d），SLC25A46 KD也會(huì)導(dǎo)致Mic19蛋白的輕微減少（圖2e,f）。此外，MG132處理不能抑制CHX（環(huán)己亞胺，蛋白質(zhì)合成抑制劑）誘導(dǎo)的對(duì)照組和Mic19 KO細(xì)胞中SLC25A46的減少（降解），表明Mic19KO引起的SLC25A46降解獨(dú)立于泛素-蛋白酶體途徑。然后，作者探討了線粒體蛋白酶對(duì)Mic19 KO誘導(dǎo)的SLC25A46降解的影響。WB分析顯示，OMA1或Yme1L的缺失會(huì)顯著抑制Mic19KO細(xì)胞中SLC25A46的降解，這表明線粒體蛋白酶OMA1和Yme1L有助于Mic19 KO引起的SLC25A46降解。此外，WB分析顯示，CLS1基因敲除降低了細(xì)胞中Mic19、Mic60和SLC25A46的蛋白水平，這表明SLC25A46和MICOS亞基的降解可能是心磷脂依賴(lài)性的。

此外，HIS-SIM成像顯示，SLC25A46 KD顯著減少了HeLa細(xì)胞中ER-線粒體的接觸（圖2g,h）。此外，TEM分析顯示，SLC25A46 KD導(dǎo)致HeLa細(xì)胞中CJs減少，但線粒體長(zhǎng)度沒(méi)有改變（圖2i-k）；而且，SLC25A46 KD顯著增加了ER和線粒體之間的距離，減少了線粒體-ER接觸的數(shù)量（圖2l,m），表明SLC25A46調(diào)控ER-線粒體接觸。值得注意的是，通過(guò)mito-keima檢測(cè)，SLC25A46 KD細(xì)胞的線粒體自噬沒(méi)有發(fā)生變化。因此，這些結(jié)果表明，Mic19與SLC25A46相互作用形成EMC2-SLC25A46-Mic19軸，有助于調(diào)控ER-線粒體接觸。

圖二：Mic19通過(guò)EMC2-SLC25A46-Mic19軸參與線粒體和ER之間的相互作用。

3.Mic19基因缺失誘導(dǎo)線粒體脂質(zhì)代謝紊亂

ER-線粒體接觸對(duì)于磷脂在ER和線粒體之間的運(yùn)輸至關(guān)重要，可調(diào)節(jié)線粒體的脂質(zhì)代謝。作者將Mic19flox/flox與在小鼠肝細(xì)胞中特異表達(dá)Cre的Albumin-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，產(chǎn)生了Mic19肝特異性基因敲除（LKO）小鼠。WB分析表明，Mic19在小鼠肝臟中被特異性消耗，但在小鼠的其他器官，包括肌肉、心臟、脾臟、腎臟和大腦中也有表達(dá)。然后，作者分離了線粒體部分，分析了3個(gè)月大的Mic19 LKO小鼠肝臟中線粒體磷脂的含量。脂質(zhì)組學(xué)分析表明，Mic19 LKO小鼠肝臟線粒體部分的磷脂酸（PA）、心磷脂（CL）、磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰絲氨酸（PS）和磷脂酰乙醇胺（PE）的豐度下降（圖3a,b），表明Mic19的缺失損害了線粒體磷脂的代謝。CL是線粒體特有的磷脂，主要位于IMM38，對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的維持至關(guān)重要。由于EMC2-SLC25A46-Mic19軸調(diào)控線粒體-ER接觸，作者研究了EMC2-SLC25A46-Mic19軸在CL代謝中的作用。作者分離了細(xì)胞的線粒體部分，并對(duì)純化的線粒體部分進(jìn)行了WB分析。進(jìn)一步的脂質(zhì)組學(xué)分析表明，Mic19KO或SLC25A46 KD細(xì)胞線粒體部分的CL水平下降（圖3c-f）。此外，作者還通過(guò)10-N-壬基吖啶橙（NAO，一種心磷脂結(jié)合染料）染色分析了對(duì)照組、Mic19 KO和SLC25A46 KD細(xì)胞中的CL水平。共聚焦成像和流式細(xì)胞術(shù)分析表明，Mic19或SLC25A46的缺失導(dǎo)致CL顯著減少（圖3g-j），表明Mic19或SLC25A46的缺失會(huì)影響CL的代謝。此外，TMRM染色和流式細(xì)胞儀分析顯示，Mic19KO和SLC25A46 KD降低了細(xì)胞線粒體膜電位，這可能是由于CL代謝受損所致。此外，WB分析顯示，在Mic19 KO或SLC25A46 KD細(xì)胞中，CLS1（心磷脂合成酶1）和Tafazzin（TAZ，催化轉(zhuǎn)酰形成成熟的心磷脂）的蛋白水平?jīng)]有變化。此外，Mic19 LKO小鼠肝臟中的CLS1或TAZ蛋白水平也保持不變。這些數(shù)據(jù)表明，Mic19或SLC25A46的缺失并不影響線粒體合成CL的能力。值得注意的是，雖然CLS1和TAZ的蛋白水平?jīng)]有變化，但許多其他因素也可能導(dǎo)致心磷脂水平降低：磷脂合成酶的活性可能受到抑制，包括酶失活修飾；此外，底物限制也可能是一個(gè)因素。因此，Mic19基因缺失通過(guò)EMC2-SLC25A46-Mic19軸誘導(dǎo)線粒體脂質(zhì)代謝紊亂。EMC2-SLC25A46-Mic19軸共同調(diào)節(jié)ER-線粒體接觸并參與線粒體脂質(zhì)代謝。

圖三：線粒體和ER之間的異常串聯(lián)導(dǎo)致線粒體中的心磷脂減少。

4.Mic19基因敲除導(dǎo)致小鼠肝臟線粒體膜紊亂和線粒體未折疊蛋白反應(yīng)

ER-線粒體接觸對(duì)于調(diào)控線粒體的多種功能至關(guān)重要。為了研究EMC2-SLC25A46-Mic19軸介導(dǎo)的ER-線粒體接觸的生物學(xué)和生理功能，作者培養(yǎng)了Mic19 LKO小鼠。Mic19 LKO導(dǎo)致包括Mic10、Mic60和Mic13在內(nèi)的MICOS復(fù)合體亞基顯著減少，并導(dǎo)致SLC25A46顯著減少（圖4a,b）。由于Mic19的缺失會(huì)影響CL的產(chǎn)生（圖3g、h），而CL對(duì)線粒體膜的組織至關(guān)重要，并與氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙有關(guān)，因此作者評(píng)估了Mic19 LKO對(duì)小鼠肝臟線粒體膜超微結(jié)構(gòu)的影響。TEM分析表明，與對(duì)照組（Mic19flox/flox小鼠肝細(xì)胞）相比，Mic19 LKO小鼠肝細(xì)胞顯示ER與線粒體之間的距離增加，ER-線粒體接觸數(shù)量減少（圖4c-e），證實(shí)Mic19 LKO損害了ER-線粒體接觸。此外，Mic19 LKO小鼠肝細(xì)胞線粒體嵴明顯減少，CJs急劇減少（圖4c,f,g），此外Mic19 LKO小鼠肝線粒體嵴膜急劇紊亂（圖4c）。因此，Mic19 LKO會(huì)導(dǎo)致小鼠肝臟線粒體膜重塑，尤其是線粒體嵴膜的紊亂。

線粒體嵴是線粒體氧化磷酸化的主要部位，而氧化磷酸化對(duì)細(xì)胞能量的產(chǎn)生至關(guān)重要。作者通過(guò)對(duì)從小鼠肝臟中分離出來(lái)的線粒體進(jìn)行Blue Native-PAGE分析，評(píng)估了Mic19 LKO誘導(dǎo)的嵴解離對(duì)線粒體氧化磷酸化的影響。引人注目的是，在Mic19 LKO小鼠肝臟線粒體中，復(fù)合體I、復(fù)合體III、復(fù)合體IV和復(fù)合體V的水平顯著下降，而復(fù)合體II的水平卻沒(méi)有下降。接下來(lái)，作者利用Oroboros O2k系統(tǒng)的高分辨率呼吸測(cè)定法分析了3個(gè)月大的Mic19flox/flox和Mic19 LKO小鼠肝細(xì)胞的耗氧率。在各種線粒體復(fù)合物抑制劑的作用下，Mic19 LKO小鼠肝臟的耗氧量持續(xù)低于Mic19flox/flox小鼠肝臟的耗氧量（圖4h），表明Mic19 LKO導(dǎo)致小鼠肝臟線粒體氧化磷酸化缺陷。此外，Mic19 LKO小鼠肝臟顯示ATP生成減少和ROS水平升高，表明Mic19 LKO誘導(dǎo)的線粒體膜紊亂導(dǎo)致線粒體應(yīng)激或功能障礙。線粒體應(yīng)激或功能障礙期間，線粒體未折疊蛋白反應(yīng)（UPRmt）被激活，導(dǎo)致包括線粒體蛋白酶和伴侶蛋白在內(nèi)的保護(hù)基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)。因此，作者研究了Mic19 LKO是否會(huì)觸發(fā)小鼠肝臟中的UPRmt。WB分析表明，在Mic19 LKO小鼠肝臟中，UPRmt相關(guān)蛋白包括線粒體蛋白酶（LONP1、ClpP）、線粒體伴侶HSP60和SOD2（UPRmt的替代標(biāo)記物）的蛋白水平顯著升高，而Tom40（線粒體標(biāo)記物）的蛋白水平?jīng)]有升高（圖4i、j），表明Mic19 LKO在體內(nèi)導(dǎo)致了UPRmt。

此外，作者還評(píng)估了Mic19 LKO對(duì)小鼠肝臟ER穩(wěn)態(tài)的影響。作者測(cè)試了Mic19 LKO對(duì)ER應(yīng)激的影響。作者通過(guò)WB分析測(cè)定了多種標(biāo)記物的表達(dá)，包括GRP78（ER應(yīng)激整體傳感器）、Atf6（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)因子）、p-eIF2α（翻譯起始因子eIF2磷酸化）和Chop（ER應(yīng)激下游蛋白）。與對(duì)照組相比，Mic19 LKO小鼠肝臟中的GRP78、Atf6、Chop和p-eIF2α蛋白水平顯著升高（圖4k、l）。此外，ER應(yīng)激抑制劑TUDCA（tauroursodeoxycholate）能顯著抑制Mic19 LKO誘導(dǎo)的小鼠GRP78、Atf6、Chop和p-eIF2α的上調(diào)。這些結(jié)果表明，Mic19 LKO觸發(fā)了小鼠肝臟的ER應(yīng)激。

綜上所述，Mic19 LKO引起的ER-線粒體接觸減少與UPRmt和ER應(yīng)激高度相關(guān)。

圖四：Mic19 LKO會(huì)導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)UPRmt和ER應(yīng)激。

5.Mic19 LKO會(huì)損害小鼠肝臟的脂肪酸代謝

為了進(jìn)一步研究Mic19介導(dǎo)的ER-線粒體接觸的生理功能和線粒體脂質(zhì)代謝紊亂，作者研究了Mic19 LKO對(duì)小鼠脂質(zhì)代謝的影響。在正常飲食條件下，Mic19 LKO小鼠的體重比同窩對(duì)照小鼠（Mic19flox/flox）顯著下降，這并不是由于食物和水?dāng)z入量減少，因?yàn)?span>Mic19 LKO小鼠的食物和水?dāng)z入量顯著增加。此外，Mic19 LKO小鼠3個(gè)月大時(shí)肝臟甘油三酯（TG）水平顯著升高，但肌肉甘油三酯、血清TG、肝臟膽固醇和血清極低密度脂蛋白（VLDL）水平?jīng)]有變化（圖5a-e）。此外，Mic19 LKO小鼠肝臟和血清游離脂肪酸（FFA）水平顯著升高（圖5f、g）。然而，Mic19 LKO小鼠肝臟中丙二酰-CoA水平和大多數(shù)脂肪生成相關(guān)基因（包括Mlycd、Fasn、Gpat2、Agpat1、Lpin1和Dgat2）的mRNA水平均無(wú)變化。此外，WB分析表明，在Mic19小鼠肝臟中，p-Acc1/Acc1（比值）和Fasn（負(fù)責(zé)從頭合成脂肪酸的主要酶）沒(méi)有發(fā)生變化，這表明Mic19 LKO可能不會(huì)影響脂肪酸的合成。這些數(shù)據(jù)表明，Mic19 LKO損傷了小鼠肝臟的脂肪酸代謝而非合成。為了進(jìn)一步探索其潛在機(jī)制，作者提取了對(duì)照組和Mic19 LKO小鼠肝臟RNA進(jìn)行測(cè)序。作者發(fā)現(xiàn)Mic19 LKO小鼠肝臟中有3145個(gè)基因上調(diào)，3133個(gè)基因下調(diào)。有趣的是，與脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因，尤其是與脂肪酸代謝相關(guān)的基因（細(xì)胞色素P450、亞油酸和花生四烯酸的代謝）在Mic19 LKO小鼠肝臟中被下調(diào)（圖5h）。因此，作者對(duì)小鼠肝臟的線粒體脂肪酸氧化進(jìn)行了分析。qRT-PCR分析顯示，在禁食條件下，Mic19 LKO小鼠肝臟中一些線粒體β氧化基因包括Cpt1a、Cpt2、Acad9和Acads的mRNA水平顯著下降（圖5i）。然而，ER應(yīng)激抑制劑TUDCA抑制了Mic19 LKO誘導(dǎo)的這些與線粒體β氧化有關(guān)的基因的減少。此外，在喂養(yǎng)和禁食條件下，Mic19 LKO小鼠肝臟中乙酰-coA的水平也明顯降低（圖5j）。這些數(shù)據(jù)表明，Mic19 LKO損傷了小鼠肝臟線粒體脂肪酸的β-氧化。

此外，眾所周知，線粒體脂肪酸β氧化可導(dǎo)致肝臟在禁食條件下產(chǎn)生酮體（生酮）。作者發(fā)現(xiàn)，在Mic19 LKO小鼠肝臟中，β-羥基丁酸（βHB，酮體之一）的生酮產(chǎn)物明顯減少（圖5k），生酮相關(guān)基因Hmgcs2和Hmgcl的mRNA水平下降（圖5l），表明Mic19 LKO小鼠肝臟的生酮過(guò)程受損。

圖五：Mic19 LKO影響小鼠的脂肪酸代謝。

此外，在小鼠代謝籠實(shí)驗(yàn)中，Mic19 LKO小鼠的耗氧量（VO2）和二氧化碳產(chǎn)生率（VCO2）也顯著增加。脂肪組織是調(diào)節(jié)能量平衡的重要器官，它不僅儲(chǔ)存能量，還是新陳代謝的調(diào)節(jié)器。包括eWAT（附睪白色脂肪組織）和iWAT（腹股溝白色脂肪組織）在內(nèi)的脂肪組織重量略有下降。然而，qRT-PCR分析顯示，在Mic19 LKO小鼠iWAT中，一些線粒體β氧化基因（包括Cpt1a、Cpt2和Acads）的mRNA水平顯著升高。這些結(jié)果表明，Mic19 LKO小鼠iWAT中脂肪分解增加，這可能是肝組織中β氧化功能受損的代償反應(yīng)，從而增加了Mic19小鼠的能量消耗。

因此，Mic19 LKO增加了小鼠肝臟中脂肪酸和總膽固醇的水平，這很可能是由于肝線粒體β氧化作用的減少。

6.Mic19 LKO會(huì)導(dǎo)致非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和肝纖維化

由于Mic19 LKO會(huì)損害小鼠肝臟線粒體的β氧化功能，作者隨后評(píng)估了Mic19 LKO對(duì)小鼠病理功能的影響。與對(duì)照組相比，Mic19 LKO使小鼠3個(gè)月大時(shí)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）的活性顯著升高（圖6a、b），表明Mic19 LKO會(huì)導(dǎo)致小鼠肝損傷。此外，Mic19 LKO小鼠（3個(gè)月大）的肝臟顯示出大量脂肪堆積（圖6c）。此外，蘇木精和伊紅（H&E）染色以及油紅O染色顯示，Mic19 LKO小鼠（3個(gè)月大）的肝臟出現(xiàn)了明顯的脂肪變性（圖6d、e）。進(jìn)一步的TEM分析顯示，與對(duì)照組小鼠相比，Mic19 LKO小鼠（3個(gè)月大）肝臟中脂滴（LDs）的數(shù)量和大小明顯增加（圖6f-h）。此外，在喂養(yǎng)或禁食條件下，Mic19 LKO小鼠肝臟（3月齡）的CD36（脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，脂肪肝的標(biāo)志物）mRNA水平是對(duì)照組小鼠肝臟的10倍以上，表明脂質(zhì)攝取可能是Mic19 LKO誘導(dǎo)小鼠肝臟脂質(zhì)積累的原因之一。這些數(shù)據(jù)表明，Mic19 LKO會(huì)導(dǎo)致3個(gè)月大的小鼠出現(xiàn)脂肪肝。此外，作者還研究了Mic19 LKO誘導(dǎo)的脂肪積累是否會(huì)導(dǎo)致肝臟炎癥。作者檢測(cè)了編碼炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的基因的表達(dá)。qRT-PCR分析顯示，在Mic19 LKO小鼠（3月齡）肝臟中，炎癥相關(guān)基因Cxcl10、Cd68和Tnf的mRNA水平顯著升高。免疫組化分析CD68染色進(jìn)一步顯示Mic19 LKO小鼠（3個(gè)月大）肝臟中單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞明顯增加，證實(shí)Mic19 LKO會(huì)導(dǎo)致3個(gè)月大小鼠慢性肝臟炎癥。此外，Masson三色染色顯示，對(duì)照組和Mic19 LKO小鼠（3個(gè)月大）的肝臟沒(méi)有差異。因此，作者的數(shù)據(jù)表明，Mic19 LKO會(huì)導(dǎo)致小鼠（3個(gè)月大）發(fā)生非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。

慢性肝臟炎癥可導(dǎo)致肝纖維化。作者接下來(lái)研究了Mic19 LKO是否會(huì)導(dǎo)致肝纖維化，這是肝病自然進(jìn)展的結(jié)果。在正常飲食條件下，Mic19 LKO小鼠（7個(gè)月大）的體重仍然低于同窩對(duì)照組。此外，7個(gè)月大的Mic19 LKO小鼠血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）仍然顯著升高（圖6i、j）。然而，與對(duì)照組相比，Mic19 LKO小鼠在7個(gè)月大時(shí)并未出現(xiàn)明顯的脂肪堆積（圖6k）。此外，對(duì)照組和Mic19 LKO小鼠（7個(gè)月大）的肝臟TG水平?jīng)]有差異（圖6l），這可能是由于小鼠的代償效應(yīng)。H&E染色顯示Mic19 LKO小鼠（7個(gè)月大）肝臟中炎癥和壞死區(qū)域明顯增加（圖6m），qRT-PCR分析顯示Mic19 LKO小鼠（7個(gè)月大）肝臟中炎癥相關(guān)基因包括Cxcl10、Cd68和Tnf的mRNA水平明顯增加。此外，Masson三色染色顯示，與對(duì)照組相比，Mic19 LKO（7個(gè)月）導(dǎo)致小鼠肝臟細(xì)胞外膠原蛋白急劇積累（圖7n），表明Mic19 LKO導(dǎo)致小鼠（7個(gè)月）肝纖維化。此外，qRT-PCR分析表明，在Mic19 LKO小鼠（7個(gè)月大）中，編碼纖維化標(biāo)志物（包括Col1a1和Col3a1）的基因的mRNA水平顯著升高。此外，Mic19 LKO小鼠（7個(gè)月大）體內(nèi)的羥脯氨酸（肝組織中的纖維化標(biāo)志物）、血清堿性磷酸酶（ALP，肝病標(biāo)志物）和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT，肝細(xì)胞損傷標(biāo)志物）水平也顯著升高。這些數(shù)據(jù)表明，Mic19 LKO會(huì)導(dǎo)致肝纖維化逐漸加重?？傊?span>Mic19 LKO會(huì)逐漸引發(fā)小鼠的NASH和肝纖維化。

圖六：Mic19 LKO導(dǎo)致小鼠患上非酒精性脂肪肝。

7.Mic19 LKO小鼠體內(nèi)重新表達(dá)Mic19可恢復(fù)肝臟脂質(zhì)代謝并阻止肝臟疾病的發(fā)生

為了確定Mic19 LKO小鼠的改變是否歸因于Mic19功能缺失機(jī)制，作者給8周齡的Mic19 LKO小鼠尾部靜脈注射編碼對(duì)照組或Mic19-Flag的腺相關(guān)病毒（AAV），使Mic19在小鼠肝臟中重新表達(dá)。在Mic19 LKO小鼠肝臟中重新表達(dá)Mic19后（圖7a），小鼠的體重恢復(fù)到對(duì)照組（Mic19flox/flox）小鼠的體重，UPRmt相關(guān)蛋白包括LONP1、ClpP、HSP60和SOD2的蛋白水平明顯低于Mic19 LKO小鼠肝臟的蛋白水平，與對(duì)照組小鼠肝臟的蛋白水平?jīng)]有差異（圖7b,c），表明Mic19的再表達(dá)極大地抑制了Mic19 LKO誘導(dǎo)的UPRmt。此外，作者還研究了Mic19重表達(dá)對(duì)小鼠ER應(yīng)激的影響。WB顯示，重表達(dá)Mic19 LKO小鼠肝臟中的GRP78、Atf6、Chop和p-eIF2α蛋白水平顯著低于Mic19 LKO小鼠肝臟中的水平，但與對(duì)照組小鼠肝臟中的水平相似，表明重表達(dá)Mic19顯著減輕了Mic19 LKO引起的小鼠ER應(yīng)激。

然后，作者研究了Mic19重表達(dá)對(duì)小鼠肝臟脂質(zhì)代謝的影響。在Mic19 LKO小鼠肝臟中重新表達(dá)Mic19后，其肝甘油三酯（TG）水平明顯低于Mic19 LKO小鼠（圖7d）。同樣，油紅O染色顯示，Mic19的再表達(dá)極大地抑制了Mic19 LKO引起的肝脂肪變性（圖7e）。此外，與Mic19 LKO相比，Mic19的再表達(dá)顯著下調(diào)了肝臟炎癥相關(guān)基因（包括Cxcl10、Cd68和Tnf）的mRNA水平（圖7f）。此外，Mic19的再表達(dá)還顯著降低了小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的水平（圖7g、h）。這些數(shù)據(jù)表明，重新表達(dá)Mic19可通過(guò)恢復(fù)肝臟脂質(zhì)代謝阻斷Mic19 LKO誘發(fā)的NASH。

作者還研究了重新表達(dá)Mic19是否能抑制Mic19 LKO引起的小鼠（7個(gè)月大）肝纖維化。H&E和Masson的三色染色顯示，Mic19的再表達(dá)顯著減少了Mic19 LKO（7個(gè)月）導(dǎo)致的小鼠肝臟壞死和細(xì)胞外膠原蛋白的積累（圖7i-l）。此外，qRT-PCR分析表明，Mic19重表達(dá)Mic19 LKO小鼠（7個(gè)月大）肝臟中編碼纖維化標(biāo)志物Col1a1和Col3a1的基因的mRNA水平明顯低于Mic19 LKO小鼠肝臟中的水平（圖7m）。這些數(shù)據(jù)表明，Mic19的再表達(dá)可阻斷Mic19 LKO（7個(gè)月）誘發(fā)的小鼠肝纖維化。因此，在Mic19 LKO小鼠中重新表達(dá)Mic19可以通過(guò)恢復(fù)肝臟脂質(zhì)代謝來(lái)阻止Mic19 LKO引發(fā)的NASH和肝纖維化。

圖七：重新表達(dá)Mic19可改善Mic19 LKO小鼠的肝損傷。

8.Mic19過(guò)表達(dá)抑制MCD誘導(dǎo)的脂肪肝

為了進(jìn)一步證實(shí)Mic19與NASH之間的聯(lián)系，作者建立了NASH小鼠模型（稱(chēng)為MCD），該模型由蛋氨酸和膽堿缺乏飲食與45%高脂飲食（HFD）組成，并在飲用水中補(bǔ)充0.1%的L-蛋氨酸。H&E和油紅O染色顯示，MCD小鼠的脂肪堆積明顯增加（圖8a、b）。此外，MCD小鼠肝臟中的總膽固醇水平和炎癥相關(guān)基因Cd68、Cxcl10和Tnf的mRNA水平也明顯升高（圖8c,d）。這些數(shù)據(jù)表明，MCD會(huì)導(dǎo)致小鼠的NASH（脂肪肝和肝臟炎癥）。然后，作者檢測(cè)了Mic19在對(duì)照組和MCD小鼠中的表達(dá)。MCD小鼠肝臟中Mic19和Mic60蛋白的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組（圖8e,f）。此外，TEM分析顯示，MCD小鼠肝細(xì)胞中線粒體嵴明顯減少，線粒體嵴連接點(diǎn)數(shù)量急劇下降（圖8g-i），表明MCD誘導(dǎo)線粒體嵴重塑，這與MCD小鼠肝臟中Mic19蛋白水平較低的數(shù)據(jù)一致。有趣的是，與對(duì)照組相比，MCD小鼠肝細(xì)胞中的ER線粒體接觸明顯減少（圖8g、j）。

然后，作者研究了過(guò)表達(dá)Mic19對(duì)MCD誘導(dǎo)的肝病的影響。將編碼Mic19-Flag的腺相關(guān)病毒經(jīng)尾靜脈注射到8周齡的MCD小鼠體內(nèi)。MCD小鼠肝臟過(guò)表達(dá)Mic19-Flag后，TG水平和炎癥相關(guān)基因Cd68、Cxcl10和Tnf的mRNA水平的上調(diào)均被抑制，并恢復(fù)到與正常飲食小鼠相似的水平（圖8k-m）。此外，H&E染色顯示，Mic19-Flag的過(guò)表達(dá)顯著抑制了MCD引起的小鼠肝臟脂肪變性（圖8n）。因此，Mic19的過(guò)表達(dá)抑制了MCD誘導(dǎo)的脂肪肝。這些結(jié)果與Mic19抑制小鼠肝病的功能一致。

圖八：患有MCD誘導(dǎo)的脂肪肝的小鼠模型顯示肝臟的Mic19水平較低。

 實(shí)驗(yàn)方法：

蛋白免疫印跡（WB)、免疫共沉淀（co-IP）、免疫熒光（IF）、免疫染色和共聚焦成像、透射電子顯微鏡（TEM）、流式細(xì)胞術(shù)、qRT-PCR、免疫組化分析

參考文獻(xiàn)：

Dong J, Chen L, Ye F, Tang J, Liu B, Lin J, Zhou PH, Lu B, Wu M, Lu JH, He JJ, Engelender S, Meng Q, Song Z, He H. Mic19 depletion impairs endoplasmic reticulum-mitochondrial contacts and mitochondrial lipid metabolism and triggers liver disease. Nat Commun. 2024 Jan 2;15(1):168. doi: 10.1038/s41467-023-44057-6. PMID: 38168065; PMCID: PMC10762189.