多種癌細(xì)胞釋放的LIF和Gal3劫持神經(jīng)信號(hào)

         神經(jīng)信號(hào)對(duì)腫瘤預(yù)后有顯著影響。然而，癌細(xì)胞如何主動(dòng)調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)以使其自身存活尚不完全清楚。在這項(xiàng)研究中，作者報(bào)告了一種重疊的大腦反應(yīng)模式，包括下丘腦室旁核，在多種外周癌癥小鼠模型中。隨后，多組學(xué)篩選確定白血病抑制因子（LIF）和半乳糖凝集素-3 （Gal3）是這些癌細(xì)胞類型釋放的觸發(fā)大腦激活的關(guān)鍵細(xì)胞因子。重要的是，這兩種細(xì)胞因子的血漿水平在不同癌癥患者中均有升高。作者進(jìn)一步證明，藥物或基因阻斷癌細(xì)胞來源的LIF或Gal3信號(hào)可以消除大腦反應(yīng)并強(qiáng)烈抑制腫瘤生長。此外，周圍交感神經(jīng)活動(dòng)的消融同樣可以恢復(fù)抗腫瘤免疫。這些結(jié)果闡明了多種癌細(xì)胞劫持神經(jīng)系統(tǒng)以促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的一種新的共享機(jī)制。該文章于2024年3月發(fā)表在《Cell research》，IF：44.1。

技術(shù)路線：

技術(shù)路線圖

1. 大腦對(duì)多種外周腫瘤反應(yīng)的重疊模式

         作者試圖探索外周腫瘤與中樞神經(jīng)系統(tǒng)通訊的機(jī)制。作為研究的切入點(diǎn)，作者使用了幾種小鼠同種異體移植模型，即LLC肺癌、RM1前列腺癌、MC38結(jié)腸癌和4T1乳腺癌。值得注意的是，這些同種異體移植模型通常被用于癌癥免疫學(xué)研究抗腫瘤免疫和MDSCs在免疫能力野生型小鼠中的作用。小鼠皮下植入每一種癌細(xì)胞系，然后對(duì)荷瘤小鼠的腦組織進(jìn)行磷酸化核糖體蛋白S6 （p-S6）的免疫染色，p-S6是神經(jīng)元激活的特異性標(biāo)志物作者全面評(píng)估了從嗅球到腦干的腦區(qū)。令人驚訝的是，作者在所有的腫瘤條件下發(fā)現(xiàn)了一個(gè)共同的大腦反應(yīng)模式，包括下丘腦室旁核（PVN），一個(gè)啟動(dòng)傳出交感信號(hào)的大腦中樞區(qū)域（圖1a， b）。此外，視交叉上核（SCN）、左右前庭核（Ve-L/-R）、三叉神經(jīng)左右中腦核（Me5-L/-R）、紅核（RN）、舌下核（12N）、以及三叉神經(jīng)左右運(yùn)動(dòng)核（5N-L/-R）在這些同種異體移植物模型中被觸發(fā)（圖1a， b）。另一方面，在與內(nèi)臟或代謝信號(hào)相關(guān)的大腦區(qū)域，如孤立束核（NTS）、左右臂旁核（PBN-L/-R）和弓形核（ARC），沒有檢測(cè)到神經(jīng)活動(dòng)（圖1c， d），這說明了癌癥誘導(dǎo)的大腦激活的特異性。

         除了同種異體移植癌癥模型，作者還評(píng)估了MMTV-PyMT小鼠的大腦激活情況，這是一種標(biāo)準(zhǔn)的原位乳腺癌遺傳模型重要的是，該遺傳模型顯示出與上述同種異體移植模型相同的一組反應(yīng)性和非反應(yīng)性腦區(qū)（圖1a-d）。這些結(jié)果表明，盡管它們的起源和突變譜不同，但多種類型的外周癌癥可能誘導(dǎo)重疊的腦反應(yīng)模式。

         為了確定腫瘤的生理負(fù)擔(dān)是否可能是大腦對(duì)不同癌癥反應(yīng)的共性的基礎(chǔ)，作者向野生型小鼠植入了一個(gè)由醫(yī)用級(jí)硅膠制成的假腫瘤。盡管這些假腫瘤有效地模仿了“真實(shí)”腫瘤的體積和重量，但它們未能在包括PVN、SCN、Ve-L/-R和Me5-L/-R在內(nèi)的特征腦區(qū)引起任何神經(jīng)活化。這一觀察結(jié)果在很大程度上排除了外周腫瘤的物理性質(zhì)參與誘導(dǎo)腦激活的可能性。

2. 白血病抑制因子（LIF）和半乳糖凝集素-3 （Gal3）是引發(fā)大腦反應(yīng)的癌細(xì)胞來源因子

         作者考慮了多種癌癥類型可能釋放相同的因子來觸發(fā)大腦激活的重疊模式的可能性。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者通過RNA測(cè)序（RNA-seq）分析了LLC、RM1、MC38和4T1異體移植模型和MMTV-PyMT遺傳模型的腫瘤轉(zhuǎn)錄組（圖1e），并鑒定出約2000個(gè)候選基因在不同癌癥類型中表現(xiàn)出共同的表達(dá)模式。同時(shí)，通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析檢測(cè)LLC、RM1、MC38或4T1細(xì)胞培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)（圖1e）。作者發(fā)現(xiàn)，114種蛋白質(zhì)在這些癌細(xì)胞的分泌組中普遍存在，其中89種被列入RNA-seq分析鑒定的候選基因列表。其中，61個(gè)候選蛋白被過濾為真正的分泌因子，即具有信號(hào)肽，其中11個(gè)具有特定受體。作者進(jìn)一步分析了這些受體在已發(fā)表的小鼠三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元（GSE213105）的單細(xì)胞RNA-seq （scRNA-seq）數(shù)據(jù)集中的表達(dá)，其軸突控制Me5-L/-R和5N-L/-R，這是多種癌癥類型激活的特征區(qū)域。通過多組學(xué)篩選，獲得了三個(gè)候選蛋白（LIF、色素上皮衍生因子和血栓反應(yīng)蛋白-1），進(jìn)行了深入的功能檢查（圖1f）。

圖1 多種外周腫瘤小鼠模型中腦反應(yīng)的重疊模式

         作者用三種候選蛋白中的每一種重組蛋白處理非荷瘤野生型小鼠，測(cè)試是否可以重現(xiàn)對(duì)外周腫瘤的相同腦反應(yīng)模式（圖2a）。值得注意的是，單次腹腔注射1 μg小鼠LIF可以有效地激活特征腦區(qū)，即PVN， SCN， Ve-L/-R， Me5-L/-R， RN， 12N和5N-L/-R，持續(xù)長達(dá)24小時(shí)（圖2b，c）。同時(shí)，讓人聯(lián)想到在荷瘤小鼠中觀察到的情況，這種LIF治療沒有引起NTS或PBN-L/-R中可檢測(cè)到的神經(jīng)活動(dòng)（圖2d，e）。此外，在LLC、RM1、MC38或4T1細(xì)胞的所有同種異體移植模型中，以及荷瘤MMTV-PyMT小鼠中，血漿LIF蛋白水平顯著上調(diào)（圖2f）。此外，在前列腺癌、膀胱癌、輸尿管癌、非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌和腎癌等多種癌癥患者中均檢測(cè)到血漿LIF水平升高（圖2g）。這些結(jié)果支持LIF是一種癌細(xì)胞衍生因子，可觸發(fā)大腦反應(yīng)。

圖2 LIF和Gal3是癌細(xì)胞衍生的因子，它們協(xié)同激活特定的大腦區(qū)域

         然而，作者注意到腹腔注射1μg重組LIF蛋白導(dǎo)致血漿水平達(dá)到~50 ng/mL，比荷瘤小鼠高100倍。另一方面，盡管單次注射2ng LIF可使其血漿水平與荷瘤條件下的水平相當(dāng)，但這種低劑量不足以引起大腦激活（圖2b，c）。這一現(xiàn)象提出了一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的問題，即可能存在其他癌細(xì)胞衍生因子在神經(jīng)激活中與LIF協(xié)同作用。為此，作者繼續(xù)對(duì)剩余的60個(gè)候選分泌因子的市售重組蛋白進(jìn)行了篩選，希望找到一個(gè)在低劑量LIF治療條件下可以誘導(dǎo)神經(jīng)活動(dòng)的重組蛋白。作者設(shè)法發(fā)現(xiàn)，雖然單獨(dú)腹腔注射5 μg半乳糖凝集素-3（Gal3）僅誘導(dǎo)非荷瘤小鼠Ve-L/-R區(qū)的神經(jīng)活動(dòng)，但它與2ng LIF協(xié)同作用，觸發(fā)所有特征腦區(qū)的反應(yīng)（圖2b，c）。順便說一句，重組LIF和Gal3蛋白在血液中的清除速度都相對(duì)較快（LIF的t1/2 = 2.9 min，Gal3的t1/2 = 3.2 min）。值得注意的是，在LLC、RM1、MC38或4T1細(xì)胞的同種異體移植模型和MMTV-PyMT遺傳模型中，血漿Gal3水平顯著上調(diào)（圖2f）。此外，不同癌癥患者血漿中Gal3水平顯著升高（圖2g）。這些結(jié)果共同確定了LIF和Gal3是多種癌癥類型釋放的與大腦溝通的關(guān)鍵因子。

3. 阻斷大腦的LIF和Gal3信號(hào)可抑制腫瘤進(jìn)展

         接下來，作者探索了癌細(xì)胞來源的LIF和Gal3信號(hào)與大腦的疾病相關(guān)性。通過CRISPR/Cas9生成LIF或Gal3基因缺失的LLC、RM1、MC38或4T1細(xì)胞，然后在小鼠同種異體移植模型中進(jìn)行測(cè)試（圖3a）。值得注意的是，這些細(xì)胞中的LIF敲除（KO）阻斷了特征腦區(qū)域（如PVN和Me5-L/-R）的癌癥誘導(dǎo)活性（圖3b，c）。有趣的是，LIF缺失的LLC、RM1、MC38或4T1細(xì)胞并沒有完全消除Ve-L/-R的神經(jīng)活動(dòng)（圖3b，c），這與上述觀察一致，即Gal3單獨(dú)可以刺激腦核（圖2b，c）。癌細(xì)胞中的Gal3 KO強(qiáng)烈地破壞了腫瘤小鼠所有特征腦區(qū)的神經(jīng)活動(dòng)（圖3b，c）。這些結(jié)果驗(yàn)證了癌細(xì)胞來源的LIF和Gal3在介導(dǎo)多種類型外周腫瘤的腦反應(yīng)中的協(xié)同作用。

         在LLC、RM1、MC38或4T1細(xì)胞的小鼠同種異體移植模型中，LIF KO或Gal3 KO阻斷腦激活可延緩腫瘤生長（圖4a）。為了進(jìn)一步支持LIF和Gal3信號(hào)的關(guān)鍵作用，作者每天用EC330（一種LIF的小分子抑制劑）治療攜帶“野生型”腫瘤的小鼠。這種藥理學(xué)方法抑制了大腦特征區(qū)域（如PVN、SCN和Me5-L/-R）的大腦反應(yīng)。與此同時(shí)，與LIF - KO的結(jié)果一致，在使用EC330處理的荷瘤小鼠中，Ve-L/-R的神經(jīng)活動(dòng)持續(xù)存在。重要的是，在“野生型”LLC、RM1、MC38或4T1細(xì)胞的小鼠同種異體移植模型中，EC330治療延遲了腫瘤生長。同樣，當(dāng)使用Gal3小分子抑制劑GB1107治療時(shí)，攜帶“野生型”腫瘤的小鼠在所有特征區(qū)域都沒有表現(xiàn)出大腦反應(yīng)。此外，這種對(duì)Gal3信號(hào)的藥理學(xué)抑制導(dǎo)致了腫瘤生長的強(qiáng)烈抑制。這些結(jié)果闡明了癌細(xì)胞來源的LIF和Gal3信號(hào)在調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展中的作用。

圖3 癌細(xì)胞來源的LIF和Gal3對(duì)大腦反應(yīng)至關(guān)重要

4. 交感信號(hào)促進(jìn)MDSC的產(chǎn)生，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展

         研究表明，MDSCs可進(jìn)一步分類為多形核MDSCs （PMN-MDSCs）或單核MDSCs （M-MDSCs），它們具有抑制CD8+ T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫的作用。作者發(fā)現(xiàn)，在LIF KO或Gal3 KO細(xì)胞的小鼠同種異體移植模型的血液和腫瘤中，PMN-MDSCs和M-MDSCs的存在減少（圖4b）。因此，與親代“野生型”細(xì)胞相比，LIF KO或Gal3 KO細(xì)胞的同種異體移植腫瘤中CD8+ T細(xì)胞的募集增加（圖4c）。這些結(jié)果表明，阻斷癌細(xì)胞來源的LIF和Gal3信號(hào)傳導(dǎo)到大腦可以增強(qiáng)抗腫瘤免疫。

圖4 阻斷LIF或Gal3信號(hào)可抑制腫瘤進(jìn)展

         因此，作者試圖確定這種癌癥誘導(dǎo)的大腦反應(yīng)所提供的神經(jīng)免疫機(jī)制。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞主要通過骨髓和脾臟等淋巴器官的骨髓生成。由于癌細(xì)胞來源的LIF和Gal3協(xié)同激活了PVN， PVN是控制輸出交感作用的中樞腦區(qū)，作者探索了特定淋巴器官的局部交感輸入是否可能調(diào)節(jié)MDSC的產(chǎn)生。作者利用Th-Cre；TrkAfl/fl小鼠模型，其中NGF高親和受體TrkA在交感神經(jīng)元中缺失。作者之前使用先進(jìn)成像技術(shù)的研究顯示Th-Cre； TrkAfl/fl小鼠骨髓和脾臟交感輸入完全消融。在小鼠同種異體移植模型中檢測(cè)Th-Cre、TrkAfl/fl（即交感神經(jīng)消融）和對(duì)照Th-Cre、TrkA+/+窩鼠。作者比較了這些荷瘤小鼠的腦活動(dòng)，揭示了交感神經(jīng)消融與對(duì)照條件下特征區(qū)域的神經(jīng)活動(dòng)水平相似。此外，交感神經(jīng)消融荷瘤小鼠的血漿LIF或Gal3水平?jīng)]有顯著變化。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了癌癥引起的大腦反應(yīng)會(huì)在交感神經(jīng)信號(hào)的上游發(fā)生。然而，Th-Cre；TrkAfl/fl小鼠的腫瘤生長明顯受到抑制（圖5a），這與這些小鼠血液和腫瘤中MDSCs減少而CD8+ T細(xì)胞增加有關(guān)（圖5b-d）。作者進(jìn)一步在Th-Cre、TrkAfl/fl和對(duì)照幼崽中檢測(cè)了LIF KO或Gal3 KO癌細(xì)胞。重要的是，在交感神經(jīng)切除和對(duì)照條件下，LIF或Gal3 KO腫瘤的生長速率是相當(dāng)?shù)模▓D5e，f），表明在這種情況下，LIF或Gal3基因缺失沒有加性效應(yīng)。這些結(jié)果支持了LIF和Gal3可以通過交感信號(hào)促進(jìn)MDSC生成以促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的觀點(diǎn)。 

圖5 癌細(xì)胞來源的LIF和Gal3通過交感信號(hào)促進(jìn)MDSC的產(chǎn)生

         接下來，作者利用交感神經(jīng)切除術(shù)的手術(shù)方法特異性地去除小鼠脾臟中的交感神經(jīng)輸入（圖6a），然后將其用于異體移植物癌癥模型。與交感神經(jīng)消融術(shù)觀察到的情況類似，脾交感神經(jīng)切除術(shù)對(duì)血漿LIF或Gal3水平?jīng)]有顯著影響。另一方面，局部去除交感輸入足以減少腫瘤小鼠脾臟（圖6b）和血液循環(huán)（圖6c）中的PMN-MDSCs和M-MDSCs，這表明脾臟中的交感信號(hào)促進(jìn)了MDSCs的產(chǎn)生。

         最后，作者從小鼠同種異體移植模型的脾臟中篩選PMN-MDSCs和M-MDSCs進(jìn)行體外培養(yǎng)。有趣的是，交感神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素（NE）提高了MDSCs中免疫抑制基因（如iNOS2、Arg1和Il-10）的表達(dá)。這種神經(jīng)免疫作用可被β2-腎上腺素受體拮抗劑完全消除（圖6d）。同時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)荷瘤小鼠的血漿LIF或Gal3水平不受外源性NE處理的影響，證實(shí)癌細(xì)胞釋放LIF或Gal3不依賴交感信號(hào)。這些結(jié)果表明，交感信號(hào)可以直接促進(jìn)MDSCs的免疫抑制功能。

圖6 交感信號(hào)直接促進(jìn)MDSCs的免疫抑制功能

結(jié)論：

         總之，該研究闡明了多種癌癥劫持神經(jīng)信號(hào)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的一種新的共享機(jī)制（圖6e），這對(duì)更好地理解癌癥神經(jīng)科學(xué)的復(fù)雜性具有廣泛的意義。

實(shí)驗(yàn)方法：蛋白質(zhì)組學(xué)分析，ELISA，小鼠腦組織免疫染色，RNA-seq

參考文獻(xiàn)：

         Xu, Q., Cao, Y., Kong, F. et al. Multiple cancer cell types release LIF and Gal3 to hijack neural signals. Cell Res (2024). https://doi.org/10.1038/s41422-024-00946-z