內(nèi)源性tRF分子通過YBX1介導(dǎo)的機(jī)制抑制乳腺癌發(fā)展
內(nèi)源性tRF分子通過YBX1介導(dǎo)的機(jī)制抑制乳腺癌發(fā)展
在應(yīng)激壓力情況下tRNA可以分解成tRFs。在本篇報道中作者發(fā)現(xiàn)Glu/Asp/Gly/Tyr的tRNAs均可以生成一系列的tRFs，它們與致癌基因3‘UTR競爭性結(jié)合YBX1蛋白, 降低了多個乳腺癌致癌轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性。這種轉(zhuǎn)錄后的沉默模式具序列特異性，這些片段有共同序列區(qū)域與YBX1識別序列相結(jié)合。作者開展一系列功能性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證tRFs抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。YBX1本身的功能是使致癌轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性增加，癌癥基因蛋白表達(dá)水平增強(qiáng)。這種tRFs產(chǎn)生的競爭性置換抑制其穩(wěn)定性和表達(dá)，也就抑制了癌癥轉(zhuǎn)移。
高度轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞通過抑制這些tRFs的感應(yīng)拮抗其抗腫瘤功能。在癌癥轉(zhuǎn)移過程細(xì)胞遇到的主要刺激是低氧環(huán)境，這時刺激產(chǎn)生的tRF可以抑制癌癥轉(zhuǎn)移。 YBX1是功能強(qiáng)大的RNA結(jié)合蛋白，涉及到很多關(guān)鍵性細(xì)胞途徑，它的基因失活導(dǎo)致胚胎死亡。通過CLIP分析其結(jié)合分子，作者發(fā)現(xiàn)tRFs結(jié)合YBX1并且取代了一系列致癌轉(zhuǎn)錄本，因此抑制了YBX1的蛋白活性。
結(jié)果：
癌癥細(xì)胞在增殖過程中會遇到各種各樣的應(yīng)激環(huán)境，主要的壓力就是低氧環(huán)境。腫瘤細(xì)胞利用許多調(diào)節(jié)系統(tǒng)來抵抗壓力帶來的的影響。作者開展乳腺癌細(xì)胞smRNA測序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相當(dāng)大的一部分小RNA序列來自于tRNA。
tRF分子來源于剪切的tRNA，這類小RNA片段可以在細(xì)菌，酵母和哺乳動物的正常和應(yīng)激條件下中檢測到。1977年左右首次在癌癥病人尿液中發(fā)現(xiàn)并報道，當(dāng)時被視作致癌分子。RNA測序結(jié)果顯示低氧情況下乳腺癌細(xì)胞系MDA中tRFs含量增加，但是在另一種高度轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系MDA-LM2沒有出現(xiàn)這種現(xiàn)象。這說明高度轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞抑制這種低氧狀態(tài)下的上調(diào)。低氧誘導(dǎo)型tRFs序列分析顯示一段共有序列的顯著富集現(xiàn)象(圖1A)。這種富集現(xiàn)象沒有在高度轉(zhuǎn)移類LM2中呈現(xiàn)。推測這些共有序列是反式作用因子與小RNA的結(jié)合位點(diǎn)。例如tRNA Glu產(chǎn)生的tRF在低氧環(huán)境MDA細(xì)胞中顯著上調(diào)，并且具有上述特征（圖B smRNA測序）。作者開展RNA pull-down實(shí)驗(yàn)，21-nt 3′生物素化的寡核苷酸的一段確定的序列被固定在鏈霉親和素磁珠上，用于結(jié)合與tRF相互作用的蛋白復(fù)合物?；蚣患治稣f明，其結(jié)合蛋白屬于核糖核蛋白復(fù)合體和壓力顆粒復(fù)合物 (圖1C)，YBX1與上述兩種蛋白家族均相關(guān)。因此深入研究YBX1蛋白，開展CO-IP實(shí)驗(yàn)，檢測YBX1與轉(zhuǎn)染的3‘生物素化tRF類似物的結(jié)合情況，同時開展內(nèi)源性YBX1與tRF類似物檢測實(shí)驗(yàn)（圖1D和1E），結(jié)果均證實(shí)二者的結(jié)合關(guān)系。
tRFs與YBX1特異結(jié)合
YBX1是一種多功能RNA結(jié)合蛋白，是Y-BOX結(jié)合蛋白家族的一員，應(yīng)用在RNA各個方面的功能。YBX1是RNA轉(zhuǎn)譯和穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)因子，參與tiRNA核糖體介導(dǎo)的核糖體活性抑制。對YBX1做CLIP分析，高通量測序結(jié)果顯示4000多個內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本與YBX1結(jié)合。大部分與YBX1的結(jié)合位點(diǎn)在3‘UTR和外顯子，少部分是在5’UTR和內(nèi)含子結(jié)合（圖2A）。大部分YBX1結(jié)合的轉(zhuǎn)錄本都過度表達(dá)，激活相關(guān)通路，包括RNA加工、轉(zhuǎn)換、細(xì)胞周期、葡萄糖代謝、紡錘結(jié)構(gòu)，及其他的關(guān)鍵信號和壓力應(yīng)激反應(yīng)。YBX1調(diào)節(jié)子的廣度和多樣性說明其對RNA體內(nèi)的平衡和增殖，及對細(xì)胞應(yīng)對內(nèi)外壓力很重要。
CLIP實(shí)驗(yàn)的高通量測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)YBX1與細(xì)胞中tRF的一個特殊的子集結(jié)合。GLy和Asp在細(xì)胞中均低表達(dá)但是與YBX1大量結(jié)合，而Lys，和,Ser是體內(nèi)高表達(dá)但是不與YBX1結(jié)合。SmRNA和 CLIP實(shí)驗(yàn)對比展示MDA細(xì)胞中tRF位置和豐度。結(jié)果說明tRF和YBX1的相互作用不是細(xì)胞中簡單的tRF豐度問題，YBX1的結(jié)合是特異性的而并非取決于表達(dá)豐度。 轉(zhuǎn)錄組分析MDA細(xì)胞系在低氧情況下，含有YBX1的細(xì)胞系顯著上調(diào)表達(dá)。這說明Trf參與低氧誘導(dǎo)，YBX1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié) (圖2D)。高度轉(zhuǎn)移的MDA-LM2細(xì)胞并沒有表現(xiàn)出YBX1-依賴低氧情況下的下調(diào)基因富集。因?yàn)?span>YBX1沒在MDA-LM2細(xì)胞系中表現(xiàn)出明顯的變化，因此推測增加的富集是TRF產(chǎn)生的，因?yàn)樗诘娃D(zhuǎn)移癌癥細(xì)胞中富集。
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