基于血漿外泌體核酸的液體活檢更適合腫瘤動態(tài)監(jiān)測
基于血漿外泌體核酸的液體活檢更適合腫瘤動態(tài)監(jiān)測
Liquid biopsies using plasma exosomal nucleic nucleci acids and plasma cell-free DNA compared with clinical outcomes of Patients with advanced cancers
目前，醫(yī)生通過手術(shù)或穿刺針取出腫瘤樣本，在顯微鏡下檢查并進(jìn)行遺傳學(xué)分析，從而做出診斷指導(dǎo)治療。這種是傳統(tǒng)意義上的組織活檢。然而由于這種方法具有侵入性的，通常只適用于腫瘤足夠大或已威脅到生命的情況。更糟的是，癌癥擴散時常常發(fā)生突變，意味著原位腫瘤組織活檢可能無法幫助治療侵入性轉(zhuǎn)移的瘤體。液體活檢的出現(xiàn)，很好的彌補了組織活檢的劣勢?；谘旱囊后w活檢提供了更加方便的監(jiān)測癌癥基因組變化的技術(shù)。通常，液體活檢常用血漿來源的無細(xì)胞DNA（cell-free DNA, cfDNA），然而，cfDNA多起源于發(fā)生凋亡或壞死的細(xì)胞，不能反映腫瘤活細(xì)胞的群體狀態(tài)。相比之下，外泌體核酸（exosomal nucleic acids, exoNA）來源于活細(xì)胞，可以更好地反映潛在的癌癥發(fā)生發(fā)展。
2017年10月19日，Clinical cancer research 在線發(fā)表的“Liquid biopsies using plasma exosomal nucleic nucleci acids and plasma cell-free DNA compared with clinical outcomes of Patients with advanced cancers”中，研究人員采用二代測序方法檢測外泌體核酸中的明星腫瘤突變基因BRAF, EGFR和KRAS，并與采用微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）和BEAMing PCR檢測的血漿cfDNA中的BRAF, EGFR和KRAS突變進(jìn)行比較，最后將實驗結(jié)果與檔案里的腫瘤組織臨床檢查和臨床結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)外泌體核酸突變檢測具有更高的特異性及靈敏性，具有更高的臨床應(yīng)用價值。外泌體核酸的低突變頻率是長生存期的一個獨立預(yù)后因素。
研究共收集了43例癌癥患者，包括20例結(jié)直腸癌患者，8例黑色素瘤患者和6例非小細(xì)胞癌患者以及數(shù)量不等的卵巢癌，甲狀腺癌以及子宮內(nèi)膜癌等。采用二代測序方法在20例含BRAFV600 突變基因的癌癥患者的外泌體核酸中成功檢出19例突變，KRASG12/G13突變在17例患者中全部檢出，在4例含EGFRexon19del/L858R突變患者中成功檢出其中3例。二代測序方法合計檢出41例突變中的39例，總體敏感性為95%,且沒有出現(xiàn)假陰性情況。DdRCR方法檢測癌癥患者的無細(xì)胞DNA合計檢出39例突變中的36例突變，總體敏感性為92%，且出現(xiàn)3例假陰性情況。BEAMing方法檢測癌癥患者血漿無細(xì)胞DNA合計檢出35例突變中的34例，總體敏感性為95%，僅出現(xiàn)1例假陰性情況。
表1 使用微滴式數(shù)字PCR或BEAMing數(shù)字PCR，二代測序等方法檢測血漿外泌體核酸和無細(xì)胞DNA中BRAF，KRAS和EGFR突變的敏感性和特異性。
| Method | Mutations | Sensitivity % (95% confidence interval) | Specificity % (95% confidence interval) |
| NGS of exoNA | BRAFV600 | 95% (75%-100%) | 100% (85%-100%) |
| KRASG12/G13 | 100% (80%-100%) | 100% (87%-100%) | |
| EGFRexon19del/L858R | 75% (19%-99%) | 100% (91%-100%) | |
| Droplet digital PCR of cfDNA | BRAFV600 | 89% (67%-99%) | 100% (85%-100%) |
| KRASG12/G13 | 95% (80%-100%) | 96% (79%-100%) | |
| EGFRexon19del/L858R | 67% (9%-99%) | 100% (90%-100%) | |
| BEAMing digital PCR of cfDNA | BRAFV600 | 93% (66%-100%) | 96% (78%-100%) |
| KRASG12/G13 | 100% (80%-100%) | 85% (62%-97%) | |
| EGFRexon19del/L858R | 100% (40%-100%) | 100% (88%-100%) |
研究人員分析了三種方法檢測基因突變頻率與患者生存率的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)三種方法檢測出的突變頻率均能顯著區(qū)分生存期長及生存期短的患者。進(jìn)一步地，研究人員結(jié)合RMH預(yù)后評分采用多協(xié)變量COX回歸分析來分析外泌體核酸和無細(xì)胞DNA的突變頻率對總生存期的預(yù)測作用，發(fā)現(xiàn)僅有二代測序檢測外泌體核酸的MAF≤4.22%這一指標(biāo)能夠預(yù)測總體生存期。
圖1 三種方法檢測KRAS, BRAF或EGFR基因突變頻率對總體生存期的預(yù)測作用。A.21例外泌體核酸低突變頻率（MAF）的患者生存期顯著長于22例高M(jìn)AF患者；B. 21例ddPCR方法檢測無細(xì)胞DNA的低MAF的患者生存期顯著長于20例高M(jìn)AF患者； C. 19例BEAMing方法檢測無細(xì)胞DNA低MAF患者生存期顯著長于19例高M(jìn)AF患者。
接著，研究人員分析了32例接受系統(tǒng)治療患者的治療失敗周期（time to treatment failure, TTF）與三種方法檢測突變基因頻率的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)三種方法檢測的突變頻率高低均能顯著區(qū)分治療失敗時間的長短。
圖2 KRAS, BRAF或EGFR突變與TTF的關(guān)系。
最后，研究人員分析了三種方法檢測的突變頻率與治療應(yīng)答的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)外泌體核酸在12例部分響應(yīng)和病情穩(wěn)定（stable disease, SD）≥6個月患者的突變頻率顯著低于20例疾病進(jìn)展或SD<6個月的患者。然而，ddPCR及BRAMing兩種方法檢測無細(xì)胞DNA的基因突變頻率在部分響應(yīng)和SD≥6個月患者及疾病進(jìn)展或SD<6個月的患者中均不存在顯著差異。
圖3 KRAS，BRAF，或EGFR突變頻率與疾病治療響應(yīng)的關(guān)系。
綜上，研究人員認(rèn)為血漿外泌體核酸的分子檢測在癌癥分子診斷中具有重要的潛在應(yīng)用價值且能預(yù)測臨床結(jié)果。
......