細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外囊泡促進(jìn)人類軟骨再生
細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外囊泡促進(jìn)人類軟骨再生
Mesenchymal Stromal/stem Cell-derived Extracellular Vesicles Promote Human Cartilage Regeneration In Vitro.
間充質(zhì)干細(xì)胞具有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化潛能，在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下不僅可以分化為造血細(xì)胞，還可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等。此外，間充質(zhì)干細(xì)胞獲取方便，易于分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和純化，多次傳代擴(kuò)增后仍具有干細(xì)胞特性，不存在免疫排斥特性。以上特點(diǎn)使得間充質(zhì)干細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于人類組織器官衰老和損傷的修復(fù)。骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一種風(fēng)濕性疾病，能夠?qū)е侣蕴弁春蜌埣?，目前沒(méi)有十分有效的治療方法。近年來(lái)，間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外囊泡在各種生理和病理情況下的功能作用逐漸受到關(guān)注。近期發(fā)表在Theranostics（IF=8.77）上的文章《Mesenchymal Stromal/stem Cell-derived Extracellular Vesicles Promote Human Cartilage Regeneration In Vitro》通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外囊泡對(duì)人軟骨再生的促進(jìn)作用，并一定程度上揭示了其作用機(jī)制。作者研究了人類骨髓來(lái)源的MSC（BMMSC）分泌的細(xì)胞外囊泡（EV）在人OA軟骨修復(fù)中的作用。為了檢測(cè)BMMSC-EVs對(duì)OA軟骨炎癥的作用，作者使用BMMSC-EV處理TNF-α刺激的OA軟骨細(xì)胞單層培養(yǎng)物，48小時(shí)后通過(guò)qRT-PCR測(cè)量促炎基因表達(dá)。為了評(píng)估BMMSC-EV對(duì)軟骨再生的影響，將BMMSC-EV添加到人OA軟骨細(xì)胞的再生培養(yǎng)物中，4周后對(duì)糖胺聚糖含量進(jìn)行分析。此外，對(duì)再生組織的石蠟切片進(jìn)行蛋白聚糖和II型膠原染色。研究結(jié)果表明，BMMSC來(lái)源EV能夠抑制炎癥介質(zhì)對(duì)軟骨穩(wěn)態(tài)的不利影響。當(dāng)與OA軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，BMMSC-EV消除了TNF-α介導(dǎo)的COX2和促炎白細(xì)胞介素的上調(diào)并抑制TNF-α誘導(dǎo)的膠原酶活性。BMMSC-EVs還促進(jìn)體外軟骨再生。將BMMSC-EV添加到從OA患者分離的軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)物中刺激這些細(xì)胞產(chǎn)生蛋白聚糖和II型膠原。以上結(jié)果表明BMMSC-EV可以是軟骨修復(fù)的重要介質(zhì)，作為軟骨再生和骨關(guān)節(jié)炎的新型治療劑具有很大的前景。
技術(shù)路線
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1. 兩個(gè)獨(dú)立健康供體的骨髓來(lái)源的MSC分泌外泌體標(biāo)記物陽(yáng)性的細(xì)胞外囊泡
圖1： 細(xì)胞外囊泡特征鑒定。A） Western blot結(jié)果顯示CD63、CD9和鈣連接蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性。B) 電鏡結(jié)果顯示BMMSC-EVs大小不均一，其中CD9和CD63陽(yáng)性的EVs大小在40nm到150nm，與外泌體大小一致。
2. 骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞內(nèi)化BMMSC來(lái)源的EVs
圖2 骨關(guān)節(jié)炎來(lái)源的軟骨細(xì)胞攝取BMMSC-EVs
3. BMMSC-EV抑制骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨細(xì)胞中TNF-α誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)
圖3：3.BMMSC-EV抑制骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨細(xì)胞中TNF-α誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)。A) B)6名骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨細(xì)胞分別用BMMSC-EVs，BMMSC條件培養(yǎng)基(BMMSC-CM)或去除EVs的BMMSC-CM (BMMSC-EDCM)處理，qRT-PCR檢測(cè)軟骨細(xì)胞基因表達(dá)水平。C) 4名骨關(guān)節(jié)炎病變軟骨細(xì)胞用BMMSC-EVs處理48h或/并用TNF-α處理24h后檢測(cè)膠原蛋白酶活性；D) BMMSC-EV孵育拯救TNF-α抑制的OA軟骨細(xì)胞的增殖。
4. BMMSC-EV在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中抑制TNF-α誘導(dǎo)的促炎性NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)
圖4：BMMSC-EV在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中抑制TNF-α誘導(dǎo)的促炎性NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)。A) B)BMSC-EVs抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB p65亞基核轉(zhuǎn)位；C）BMMSC-EV消除TNF-α誘導(dǎo)的IκBα磷酸化。
5. BMMSC-EV促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞產(chǎn)生蛋白多糖和II型膠原
圖5：BMMSC-EV促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞產(chǎn)生蛋白多糖和II型膠原。A) B) BMMSC-EV在OA軟骨細(xì)胞中上調(diào)蛋白質(zhì)水平的蛋白聚糖表達(dá)。C)BMMSC-EVs上調(diào)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中ACAN的表達(dá)水平。
6. BMMSC-EVs通過(guò)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞促進(jìn)蛋白聚糖和II型膠原產(chǎn)生
圖6：BMMSC-EVs通過(guò)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞促進(jìn)蛋白聚糖和II型膠原產(chǎn)生。A) BMMSC-EVs上調(diào)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞collagenII蛋白表達(dá)水平; B) COLII表達(dá)在BMMSC-EVs處理的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中顯著升高; C) 軟骨細(xì)胞再生相關(guān)的基因表達(dá)在BMMSC-EVs處理后，表達(dá)量顯著升高；D) 肥大軟骨細(xì)胞分化相關(guān)的基因表達(dá)在BMMSC-EVs處理后顯著下調(diào); E) BMMSC-EVs促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞代謝活性; F) BMMSC-EVs促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖。
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