microRNA實時定量PCR

               microRNA實時定量PCR檢測服務(wù)
實時熒光定量PCR技術(shù)是在普通PCR反應(yīng)體系中加入熒光試劑，通過儀器對擴(kuò)增過程中每一個循環(huán)的熒光信號進(jìn)行實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量或定性的分析的方法。實時熒光定量PCR能夠?qū)Ｒ?、靈敏、快速、高重復(fù)性地精確定量起始模板濃度。成熟microRNA是由21-25個核苷酸組成的小RNA，由于長度太短，不能通過傳統(tǒng)的實時定量PCR進(jìn)行檢測。本公司通過特殊設(shè)計的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物，配合實時定量PCR引物及SYBR? Green熒光染料可以精確檢測微量樣品中microRNA表達(dá)水平。
本公司提供的microRNA實時定量PCR檢測服務(wù)具有以下特點：①高特異性——只對成熟MicroRNAs進(jìn)行定量，而不受其前體干擾；還可以在高度同源性的microRNAs之間進(jìn)行區(qū)分，在某些實驗中甚至只有一個堿基的差異都能鑒別。②快速，簡單——整個操作只需兩步，不到3個小時，即可獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。③靈敏——樣品消耗少，僅需1-10ng的total RNA或同等物；如此之高的靈敏度使得研究者可以用有限的樣品做更多的實驗，比如做全套microRNAs表達(dá)譜研究。也有利于諸如干細(xì)胞，配對的人類腫瘤/健康對照等珍貴且很難獲得的樣品的節(jié)約使用。④超寬的線性范圍——可跨越7個數(shù)量級，這意味著研究者可以準(zhǔn)確的知道所用實驗材料的每個細(xì)胞所含的目標(biāo)microRNA分子多還是少（這一點很重要，因為microRNA的表達(dá)豐度在不同種類的細(xì)胞，組織以及疾病中變化范圍很大）。⑤具有很好的重復(fù)性，由不同的研究者操作時也能體現(xiàn)。
英拜生物為您提供microRNA 實時定量PCR技術(shù)服務(wù)，您只需要提供保存完好的組織或細(xì)胞標(biāo)本，本公司專業(yè)的技術(shù)服務(wù)人員就可替您完成microRNA實時定量PCR實驗操作和數(shù)據(jù)分析，提供給您完整的實驗報告，為您節(jié)省大量的時間和精力。
英拜生物microRNA實時定量PCR技術(shù)服務(wù)流程如下：

1. 引物設(shè)計、合成
   設(shè)計并合成目的microRNA的莖環(huán)RT引物、PCR引物。

2. 樣品RNA抽提
   a．組織樣品：取適量（50～100mg）新鮮組織或正確保存的組織樣品，勻漿后抽提RNA。
   b．細(xì)胞樣品：取1×106～1×107細(xì)胞，吸去培養(yǎng)液后用TRIZOL試劑抽提RNA。

3. RNA質(zhì)量檢測
   a．紫外吸收測定法測定RNA在波長260nm和280nm的吸收值，獲得RNA的濃度并通過A260/280及A260/230的吸收比值判斷RNA的純度。
   b．用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度和完整性。
   注：用于microRNA實時定量PCR檢測的RNA樣品，必須高純度、完整，沒有RNase 污染（降解的樣品不能用于實時定量PCR檢測），同時提取方法必須保證所得樣品包含完整的小RNA部分。

4. 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA
   利用莖環(huán)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

5. 實時定量PCR
   以合成的cDNA作為模板進(jìn)行實時定量PCR擴(kuò)增（同時測定每個樣品中U6 snRNA含量作為內(nèi)參以校正上樣誤差）。

6. 分析結(jié)果、提供實驗報告
   分析實時定量PCR結(jié)果，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量樣品中的目的microRNA。提供實驗報告，包括詳細(xì)的實驗方法，實時定量PCR實驗數(shù)據(jù)和圖表。