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RNA pull-down實驗

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RNA pull-down實驗

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產(chǎn)品詳細(xì)

簡介：	使用體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記生物素RNA探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其他成分分離。復(fù)合物洗脫后，通過western blot實驗檢測特定的RNA結(jié)合蛋白是否與RNA相互作用。
提供商：	yingbio
服務(wù)名稱：	RNA pull-down實驗
地區(qū)：	上海i

RNA pull-down實驗

RNA pull-down實驗是檢測與目的RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。使用體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記生物素RNA探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其他成分分離。復(fù)合物洗脫后，通過western blot實驗檢測特定的RNA結(jié)合蛋白是否與RNA相互作用。

一、實驗流程圖

二、實驗流程
（一）質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、涂板、搖菌
1. 取JM109感受態(tài)細(xì)菌80μl，加入1.5mlEP管中，用10μl槍頭沾取質(zhì)粒加入上述EP管中，混勻。
2. 冰上靜置30min。
3. 42℃熱休克90-120s1。
4. 迅速移至冰上靜置2min。
5. 在超凈臺內(nèi)，于上述EP管中加入50μl LB培養(yǎng)基（Amp－），37℃，160rpm搖床，增菌0.5-1h。
6. 菌液4,000rpm離心10min，棄大部分上清，將沉淀重懸，菌液全部加入LB平板（Amp+）上，涂布均勻，37℃倒置培養(yǎng)（過夜12-15h）。
7. 將37℃培養(yǎng)（12-16h）平板取出，于無菌操作臺中挑取單克隆放入內(nèi)含5ml LB培養(yǎng)基（Amp+）的15ml離心管中，于37℃、250rpm搖床增菌過夜18H,看菌液是否渾濁。菌液渾濁后進行質(zhì)粒中提。
（二）質(zhì)粒中提
（三）質(zhì)粒線性化
（四）瓊脂糖凝膠電泳
（五）膠回收
六. 轉(zhuǎn)錄以及生物素標(biāo)記：
1.取無RNA酶管，按下表操作：

1μg線性化DNA	xμl
Biotin RNA Labeling mix	2μl
10×Transcription buffer	2μl
RNA Polymerase	2μl
補足RNase-free水至18μl

2. 取出孵育好的EP管，加入2μl的DNaseⅠ，37℃孵育15min以除去體系中的DNA。
3. 取出上述操作的EP管，加入2μl0.2M EDTA（pH=8.0）終止反應(yīng)。
4. 取1μg Biotin標(biāo)記的RNA，加入適量Structure Buffer,使得RNA形成二級結(jié)構(gòu)。然后將RNA 95℃加熱2min，冰浴3min，室溫靜置30min。
5. 磁珠準(zhǔn)備：使用RIP Wash Buffer 500μl沖洗磁珠3次。
6. 用50μl RIP Wash Buffer重懸磁珠，然后將其加入到生物素標(biāo)記并變性的RNA中，4℃過夜。
7. 過夜的混合物3000rpm離心1min，去上清。
8. RIP Wash Buffer沖洗3次，切記將液體沿壁加入或者滴加，上下緩慢翻轉(zhuǎn)混勻，切勿用移液器吹打。
9. 往磁珠-RNA混合物中加入細(xì)胞裂解液，裂解液中加入適量RNase抑制劑，室溫放置1h。
10. 將孵育好的磁珠-RNA-蛋白混合物低速離心，上清回收，使用RIP Wash Buffer沖洗3次，1次1ml。
11. 于樣品中加5×SDS上樣緩沖液，95℃變性10min，跑SDS-PAGE凝膠。
12. 考染：取出SDS-PAGE凝膠于考馬斯亮藍染色液中，搖床過夜。次日用考馬斯亮藍脫色液脫色1~2h，中間更換幾次脫色液至條帶清晰，背景低為止。
13. 將目的條帶切下送測序 (質(zhì)譜檢測、WB檢測)。

資料下載： RNA-pull down實驗服務(wù).pdf