m6A RNA甲基化測序

m6A RNA甲基化測序

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m6A RNA甲基化測序
     RNA甲基化修飾約占所有RNA修飾的60%以上，而N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine, m6A）是高等生物mRNA和lncRNAs上最為普遍的修飾。目前發(fā)現(xiàn)microRNA，circRNA, lncRNA, rRNA, tRNA和snoRNA上都有發(fā)生m6A修飾。 m6A修飾主要發(fā)生在RRACH序列中的腺嘌呤上，其功能由“編碼器(Writer)”、“消碼器(Eraser)”和“讀碼器(Reader)”決定?！熬幋a器(Writer)”即甲基轉(zhuǎn)移酶，目前已知這個復(fù)合物的成分有METTL3，METTL14, WTAP和KIAA1429；而ALKBH5和FTO作為去甲基酶（消碼器）可逆轉(zhuǎn)甲基化；m6A由m6A結(jié)合蛋白識別，目前發(fā)現(xiàn)m6A結(jié)合蛋白（讀碼器）有YTH結(jié)構(gòu)域蛋白（包括YTHDF1, YTHDF2,YTHDF3， YTHDC1和YTHDC2）和核不均一蛋白HNRNP家族（HNRNPA2B1和 HNRNPC）。在基因表達、蛋白翻譯和RNA剪切等正常生物過程中具有重要作用。近來有研究顯示m6A RNA甲基化在乳腺癌、惡性血液病、膠質(zhì)母細胞瘤、宮頸癌等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

 
       圖 1 m6A修飾的酶系統(tǒng)               圖 2 m6A生物學(xué)功能


一、MeRIP-seq實驗流程

圖3 英拜 m6A RNA甲基化測序?qū)嶒灹鞒?

二、m6A甲基化測序分析內(nèi)容

u  測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估及QC

u  測序序列與參考基因組比對

u  RNA甲基化peak calling                  

u  peak在基因組中的分布及注釋

u  Peak在基因組中富集程度統(tǒng)計   

u  差異RNA甲基化區(qū)域分析

u  差異RNA甲基化區(qū)域GO與KEGG富集分析 



三、研究案例

1、m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicity of Glioblastoma Stem-like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Program. Cancer Cell 2017.(IF=27.4)
    DNA甲基化異常是膠質(zhì)瘤的表觀遺傳調(diào)控因子，但RNA甲基化在腫瘤包括惡性膠質(zhì)瘤（GBM）中的調(diào)控還尚未清楚。為研究m6A調(diào)節(jié)可能導(dǎo)致GBM患者臨床療效不佳，作者通過TCGA數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)ALKBH5在惡性膠質(zhì)瘤樣干細胞（GSCs）中高表達且與GBM 病人不良預(yù)后相關(guān)，干擾ALKBH5  降低GSCs細胞的自我更新能力且抑制GSCs增殖，進一步體內(nèi)驗證敲除ALKBH5可抑制腫瘤生長。
    為研究ALKBH5的m6A作用機制，作者利用芯片和m6A-seq篩選到膠質(zhì)瘤增殖相關(guān)的FOXM1，最后通過qPCR、WB、免疫熒光、核質(zhì)分離WB/qPCR、RIP和MeRIP等實驗證明ALKBH5通過去甲基化調(diào)節(jié)FOXM1在GSCs中的表達。
    為研究ALKBH5對FOXM1的作用是否受其他因子的調(diào)節(jié)，作者研究了FOXM1的鄰近基因，發(fā)現(xiàn)lncRNA FOXM1-AS與FOXM1序列互補，且共表達、共定位，進一步通過RIP, RNA pull down等實驗證明lncRNA FOXM1-AS促進ALKBH5 和FOXM1初級轉(zhuǎn)錄本的相互作用。最后通過細胞實驗進一步驗證ALKBH5在lncRNA FOXM1-AS的作用下維持FOXM1的表達和細胞增殖，從而維持GSCs的干性。





圖4 ALKBH5敲除細胞中m6A修飾的特征和基因表達的變化
2、RNA N6-methyladenosine methyltransferase METTL3 promotes liver cancer progressionthrough YTHDF2 dependent post-transcriptional silencing of SOCS2. Hepatology,2017.(IF=13.2)
表觀遺傳改變極大地促進了人類癌癥的發(fā)生。傳統(tǒng)的表觀遺傳研究主要集中在DNA甲基化，組蛋白修飾和染色質(zhì)重構(gòu)。最近，RNA各種可逆的化學(xué)修飾被認為是一種新的表觀遺傳調(diào)控方式。m6A是真核生物mRNA最常見的化學(xué)修飾，在調(diào)控mRNA穩(wěn)定性，剪切和翻譯方面具有重要的作用。
    作者使用轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)了METTL3（甲基轉(zhuǎn)移酶3），一種主要的RNA N6-腺苷-甲基轉(zhuǎn)移酶，在人肝細胞癌（HCC）和多種實體腫瘤中顯著高表達。在臨床上，METTL3的過度表達與肝細胞癌患者不良預(yù)后有關(guān)。體外實驗證明敲除METTL3會顯著抑制HCC細胞增殖，遷移及克隆形成。體內(nèi)實驗證明敲除METTL3會明顯抑制HCC體內(nèi)成瘤和肺轉(zhuǎn)移。另外，使用CRISPR/dCas9-VP 64激活系統(tǒng)，內(nèi)源性高表達METTL3會顯著促進HCC細胞在體外和體內(nèi)生長。通過轉(zhuǎn)錄組測序、m6A-Seq、MeRIP-PCR，作者確定了SOCS2（細胞因子信號2的抑制因子）作為METTL3介導(dǎo)的m6A修飾的下游靶基因。 敲除METTL3表達會消除SOCS2 mRNA m6A修飾并增強SOCS2 mRNA表達。m6A介導(dǎo)的SOCS2 mRNA降解是依賴于m6A“讀取器”蛋白YTHDF2?？傊琈ETTL3在HCC大部分高表達中,并通過m6A-YTHDF2依賴機制抑制SOCS2表達從而促進HCC進展。因此，作者發(fā)現(xiàn)了在肝腫瘤發(fā)生過程中表觀遺傳改變的一種新機制。

圖5 RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶METLLT3在肝癌組織中高表達
（轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果及TCGA數(shù)據(jù)庫分析）
3、N6-adenosine methylation in MiRNAs. PLoS One 2015,
     在許多不同種類的RNA中，都已觀察到N6 -腺苷(m6A)的甲基化，但其在microRNAs中還沒有被研究。研究者在FTO1C1, FTO2D4 和 FTO3C3細胞系中，通過敲除m6A甲基轉(zhuǎn)移酶FTO篩選到表達差異的microRNA,說明miRNA受m6A甲基化的調(diào)控。進一步通過MeRIP-Seq發(fā)現(xiàn)相當(dāng)一部分的microRNA具有m6A修飾。通過motif分析，他們發(fā)現(xiàn)了區(qū)分甲基化和非甲基化microRNA的一致序列。該文章所述的表觀遺傳修飾在基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的復(fù)雜性上增加了一個新的層次。

圖7 FTO敲除對甲基化的miRNAs的穩(wěn)定狀態(tài)的影響。


四、送樣要求

A樣品要求：

  1. 樣品類型：細胞、新鮮組織或RNA樣品。

  2. 樣品量：細胞樣品請?zhí)峁┲辽?×107~108個細胞，組織樣品請?zhí)峁┲辽?g的組織塊，RNA樣品請?zhí)峁?00μg以上的總RNA。

  3. 樣品質(zhì)量：RNA無明顯降解，提取的總RNA OD260/280值在1.8～2.2之間，濃度 ≥ 500ng/μl，28S:18S ≥ 1.5，RIN ≥7。

  4. 樣品保存：細胞樣品或新鮮組織塊（切成～50mg的小塊）可用TRIZOL或RNA保護劑處理或液氮凍存后，-80℃保存。RNA樣品可溶于乙醇或RNA-free的超純水中，-80℃保存。樣品保存期間避免反復(fù)凍融。

  5. 樣品運輸：樣品置于1.5 ml管中，封口膜封好，干冰運輸。



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