高分文章揭示細(xì)胞核circRNA新機(jī)制

高分文章揭示細(xì)胞核circRNA新機(jī)制

   很多人都會(huì)有這樣的疑問(wèn)， circRNA定位在細(xì)胞核中嗎？其實(shí)，環(huán)狀RNA（Circular RNA, CircRNA）主要在細(xì)胞漿中富集，只有少數(shù)定位于細(xì)胞核。目前文章報(bào)道的circRNA 主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，通過(guò)ceRNA機(jī)制發(fā)揮作用。那么細(xì)胞核中的circRNA 又具有什么功能呢？4月3日，知名免疫雜志Immunity （IF=22.8）發(fā)表了中科院生物物理所范祖森教授課題組的文章，首次報(bào)道 circRNA Cia-cGAS（作者以結(jié)合的蛋白命名）定位于細(xì)胞核中，通過(guò)結(jié)合cGAMP合成酶cGAS并抑制其酶活性，降低IFNs表達(dá)，維護(hù)靜息狀態(tài)的長(zhǎng)效造血干細(xì)胞（LT-HSC）免受耗竭。（文章題目：A Circular RNA Protects Dormant Hematopoietic Stem Cells from DNA Sensor cGAS-Mediated Exhaustion）。

   成人造血干細(xì)胞（HSC）在骨髓內(nèi)多以靜息狀態(tài)存在，同時(shí)保持著自我更新和分化的潛能，自我更新與分化穩(wěn)態(tài)的破壞會(huì)導(dǎo)致骨髓衰竭或血液惡性腫瘤。長(zhǎng)期造血干細(xì)胞（Long-term HSCs , LT-HSCs）作為潛能最高的干細(xì)胞系，為短期造血干細(xì)胞（ST-HSC）、多能干細(xì)胞（MPP）等祖細(xì)胞提供了持續(xù)性細(xì)胞補(bǔ)給。然而，HSCs如何維持其靜息狀態(tài)，并避免I型干擾素(IFN)介導(dǎo)的衰竭尚未清楚。

研究路線：

1確定目標(biāo)circRNA

為研究circRNAs對(duì)HSCs自我更新的影響，作者采用小鼠circRNA芯片在LT-HSCs 和MPPs兩種細(xì)胞中篩選差異表達(dá)circRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)49個(gè)circRNA 在LT-HSCs中上調(diào) （A），RT-PCR驗(yàn)證到9個(gè)上調(diào)circRNA (B)；northern blot鑒定這些circRNA (C)后， 進(jìn)一步將這9個(gè)circRNA對(duì)應(yīng)的 shRNAs 慢病毒移植小鼠發(fā)現(xiàn)只有Cia-cGAS影響HSCs的亞群分布 (D,E,F,G)，同時(shí)確定干擾母基因線性RNA并無(wú)明顯表型。接下來(lái)就是在小鼠不同組織，不同類型細(xì)胞中通過(guò)northern blot 和RT-PCR（一對(duì)convergent引物、一對(duì)divergent引物）驗(yàn)證Cia-cGAS的存在性，普遍性和保守性 (H,I,J)。并通過(guò)FISH和核質(zhì)分離PCR發(fā)現(xiàn)Cia-cGAS位于細(xì)胞核中(K,L),其對(duì)應(yīng)線性RNA位于細(xì)胞質(zhì)而(附圖)。

2.Cia-cGAS具有哪些功能？（維持LT-HSCs的靜息狀態(tài)）

作者通過(guò)迷你系統(tǒng)迷你基因載驗(yàn)證Cia-cGAS序列上下游內(nèi)含子中的反向互補(bǔ)序列是成環(huán)的關(guān)鍵，因此在內(nèi)含子反向互補(bǔ)序列處設(shè)計(jì)引物，通過(guò)CRISPR/Cas9在小鼠內(nèi)進(jìn)行Cia-cGAS敲除 （A,B,C）。分離小鼠骨髓HSC細(xì)胞通過(guò)流式確定敲除Cia-cGAS后LT-HSCs細(xì)胞數(shù)和百分比下降(D,E,F)，且成熟的造血細(xì)胞數(shù)量也下降(H)，骨髓切片HE染色發(fā)現(xiàn)有核細(xì)胞減少(G)。同時(shí)BrdU腹腔注射小鼠后流式分析LT-HSCs的BrdU信號(hào)，發(fā)現(xiàn)Cia-cGAS敲除后BrdU信號(hào)增強(qiáng)(I)；細(xì)胞周期分析LT-HSCs表明現(xiàn)，Cia-cGAS敲除處于S/G2/M活躍狀態(tài)的后LT-HSCs細(xì)胞數(shù)增多 (J)。這些結(jié)果表明Cia-cGAS維持LT-HSCs的靜息狀態(tài)。

3.Cia-cGAS通過(guò)哪些基因調(diào)控LT-HSCs的靜息狀態(tài) ？（IFN）

確定circRNA 功能后，接下來(lái)作者研究其作用機(jī)制。通過(guò)mRNA芯片在cia-cGAS+/+ 和cia-cGAS–/– LT-HSCs中篩選差異表達(dá)基因(A)。篩選上調(diào)的已報(bào)道調(diào)控HSC活躍狀態(tài)的IFN。并通過(guò)PCR 和ELISA 驗(yàn)證IFN的表達(dá)（B,C）. 通過(guò)回復(fù)實(shí)驗(yàn)，確定IFN敲除 后能回復(fù)cia-cGAS敲除造成的靜息破壞（E,F,G,H）

4.Cia-cGAS通過(guò)什么機(jī)制調(diào)控IFN?  (結(jié)合蛋白cGAS)

因?yàn)镃ia-cGAS位于細(xì)胞核中，所以其可能通過(guò)結(jié)合蛋白（如：酶類，轉(zhuǎn)錄因子）來(lái)調(diào)控mRNA的合成。作者以Cia-cGAS對(duì)應(yīng)的線性RNA為探針進(jìn)行RNA pull down,通過(guò)質(zhì)譜篩選拉下的蛋白（A），篩選到已報(bào)道通過(guò)合成GAMP, 而調(diào)控IFN 的合成酶cGAS。進(jìn)一步，通過(guò)特異抗體WB 和RIP驗(yàn)證（B,C）. 接下來(lái)確定Cia-cGAS和cGAS共定位：免疫熒光，質(zhì)分離WB,和免疫熒光共定位（D,E,F）.  進(jìn)一步確定結(jié)合位點(diǎn)：生物信息學(xué)分析Cia-cGAS對(duì)應(yīng)線性RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)（G）, 位點(diǎn)突變后進(jìn)行EMSA 和AlphaScreen （H,I,J,K）

5.Cia-cGAS 對(duì)結(jié)合蛋白的調(diào)控？ （抑制其酶活性）

cGAS 通過(guò)結(jié)合DNA，催化cGAMP合成。因此作者研究Cia-cGAS結(jié)合cGAS對(duì)其結(jié)合DNA能力的影響。通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性EMSA試驗(yàn)，對(duì)cGAS孵育不同量的Cia-cGAS看其結(jié)合DNA 的能力變化（A）,并反面驗(yàn)證（B）; 同時(shí)用RNA pull down 和DNA pull down 驗(yàn)證 （C,D）。通過(guò)TLC，ChIP， reverse phase-HPLC，luciferase assay 驗(yàn)證Cia-cGAS敲除對(duì)cGAMP合成的影響 （E,F,G,H）.

6.Cia- cGAS /結(jié)合蛋白/靶基因 對(duì)LT-HSCs靜息狀態(tài)和免疫的調(diào)控

最后就是調(diào)控通路回到細(xì)胞表型上，通過(guò)回復(fù)性試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。聯(lián)合敲除Cia-Cgas/和結(jié)合蛋白后，實(shí)驗(yàn)方法跟功能研究實(shí)驗(yàn)一樣。

7.Cia- cGAS作用機(jī)制圖