Oncogene:缺氧誘導(dǎo)的外泌體促進(jìn)卵巢癌更具侵襲性和化療抗性:一種連接STAT3 / Rab蛋白的新機(jī)制
Oncogene:缺氧誘導(dǎo)的外泌體促進(jìn)卵巢癌更具侵襲性和化療抗性:一種連接STAT3 / Rab蛋白的新機(jī)制
眾所周知，所有的真核細(xì)胞通過分泌稱為“外泌體”的小囊泡（大小為40-100nm），跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)遺傳信息來保持與局部環(huán)境的接觸。外泌體在包括癌癥在內(nèi)的許多疾病的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。缺氧被認(rèn)為是促進(jìn)上皮腫瘤擴(kuò)散的關(guān)鍵因素，缺氧介導(dǎo)的腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和耐藥性是卵巢癌的主要臨床挑戰(zhàn)。在缺氧腫瘤微環(huán)境中釋放的外泌體可能通過在癌細(xì)胞和正常細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移信號蛋白而促成這些臨床難治表型。
近期發(fā)表在Oncogene（IF=7.519）上的文章《Hypoxia-induced exosomes contribute to a more aggressive and chemoresistant ovarian cancer phenotype: a novel mechanism linking STAT3/Rab proteins》發(fā)現(xiàn)處于缺氧環(huán)境的卵巢癌細(xì)胞通過上調(diào)Rab27a，下調(diào)Rab7、LAMP1 / 2、NEU-1以及促進(jìn)更偏分泌型溶酶體表型而顯著增加其外泌體釋放。研究結(jié)果表明，缺氧環(huán)境中卵巢癌細(xì)胞衍生的外泌體（HEx）在增強(qiáng)卵巢癌轉(zhuǎn)移/化療耐藥性方面更有效，可能成為腫瘤轉(zhuǎn)移，化療耐藥和改善臨床結(jié)局的干預(yù)措施之一。
技術(shù)路線
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1. 常氧卵巢癌細(xì)胞分泌的外泌體（NEx）和低氧卵巢癌細(xì)胞分泌的外泌體（HEx）的分離、鑒定和蛋白質(zhì)組學(xué)研究
Figure 1
圖1 外泌體的分離和鑒定 A）B）納米粒子跟蹤分析（NTA）結(jié)果顯示相對于永生化卵巢上皮細(xì)胞(IOSE385、386)和永生化輸卵管分泌上皮細(xì)胞（FT-33），卵巢癌細(xì)胞系（OVCAR8、TR127、TR182）的外泌體濃度明顯更高，而外泌體的大小沒有明顯差異。C）低溫透射電子顯微鏡驗(yàn)證OVCAR8和TR127細(xì)胞的大小形態(tài)。D）常氧條件下，Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)在OVCAR8和TR127細(xì)胞分離的外泌體裂解物中有外泌體表面標(biāo)志物EpCAM、TSG101和CD63的存在，順式高爾基體蛋白GM130用于驗(yàn)證囊泡純度。E)分別在常氧和低氧條件下孵育卵巢癌細(xì)胞，評估氧張力對其釋放外泌體的影響，結(jié)果顯示，缺氧時不同細(xì)胞系釋放外泌體的量是常氧條件下的3-6倍。F）分別對常氧和缺氧環(huán)境下腫瘤細(xì)胞來源外泌體進(jìn)行LC-MS/MS質(zhì)譜分析，篩選差異蛋白后做GO富集分析，結(jié)果表明與來自OVCAR8細(xì)胞的常氧外泌體相比，缺氧外泌體中大多數(shù)外泌體蛋白與細(xì)胞過程，代謝過程和生物調(diào)節(jié)相關(guān)。G）外泌體蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集的IPA(Ingenuity Pathway Analysis)分析顯示數(shù)據(jù)集中確定的生物分子列表與前六種不同的疾病和功能相關(guān)。
Figure 2
圖2 缺氧有利于增加溶酶體與質(zhì)膜的對接A）B）用共聚焦顯微鏡觀察卵巢癌細(xì)胞系（A2780和OVCAR8）顯示缺氧會增加卵巢癌細(xì)胞釋放外泌體，蛋白質(zhì)含量也顯著增加。C）競爭ELISA法檢測結(jié)果顯示，缺氧時溶酶體胞外分泌的β-氨基己糖苷酶A濃度增加，并通過使用BAF-A1（自噬抑制劑）與常氧處理OVCAR8進(jìn)一步驗(yàn)證。D）IOSE在常氧下顯示溶酶體的核周定位。E）從患者腹水（低氧環(huán)境）分離的細(xì)胞中進(jìn)一步證實(shí)了LAMP1（綠色）的周邊溶酶體共定位（紅色）。F）與常氧相比，低氧條件下LAMP1/2的mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)，且NEU-1（溶酶體胞吐作用的負(fù)性調(diào)節(jié)劑）的mRNA表達(dá)下調(diào)。
Figure 3
圖3在缺氧條件下Rabs表達(dá)的改變：STAT3在囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)過程調(diào)節(jié)Rab7和27a A）B）Rab7和27a的蛋白和mRNA表達(dá)在常氧和缺氧條件下呈負(fù)相關(guān)。C）缺氧條件下敲減（KD）STAT3會顯著減少外泌體濃度。D）與OVCAR8 WT（缺氧）相比，STAT3 KD增加了Rab7的表達(dá)并顯著降低了Rab27a的表達(dá)。E）分別測量STAT3過表達(dá)（OE）、敲減和 OVCAR8細(xì)胞的外泌體濃度，顯示STAT3過表達(dá)外泌體濃度顯著增加，敲減STAT3使得外泌體濃度減少。F）比較缺氧OVCAR8-WT和STAT3 KD的結(jié)果，顯示后者溶酶體數(shù)量顯著減少。G）分別測量OVCAR8-HC、HIF(缺氧誘導(dǎo)因子) KD和STAT3 KD中外泌體濃度，敲減STAT3后外泌體濃度明顯減少，而敲減HIF不會造成明顯影響。
4. 評估HEx在體外遷移/入侵中的作用
Figure 4
圖4 外泌體內(nèi)化及其對受體細(xì)胞中腫瘤遷移和轉(zhuǎn)移的影響 A）將HEx用System Biosciences-SBI標(biāo)記，并與條件培養(yǎng)基中的OVCAR8細(xì)胞共培養(yǎng)，共聚焦顯微鏡證實(shí)24h后外泌體內(nèi)化。B）運(yùn)用Image J軟件分別定量低氧條件和非低氧條件下，正常細(xì)胞（IOSE和FT-33細(xì)胞）和卵巢癌細(xì)胞系(OVCAR8)的遷移百分比，結(jié)果低氧條件下遷移率均有所上升。C）D）用細(xì)胞入侵Transwell測定試劑盒分析OVCAR8細(xì)胞的侵襲性潛力，結(jié)果顯示與HEx共培養(yǎng)后侵入膜的細(xì)胞數(shù)目顯著增加，OVCAR細(xì)胞遷移百分比上升。E）NEx和HEx與條件培養(yǎng)基中的A2780和OVCAR8細(xì)胞在常氧下共培養(yǎng)一周，發(fā)現(xiàn)致癌蛋白（T/pSTAT3、Tyr705）和參與遷移/侵襲的蛋白質(zhì)（MMP2）含量增加。F）進(jìn)一步證實(shí)STAT3在IOSE和OVCAR8細(xì)胞系的外泌體中的表達(dá)，且它的活化形式僅在缺氧時從OVCAR8分離的外泌體內(nèi)觀察到。G）與從細(xì)胞計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化的永生化癌細(xì)胞釋放的量相比較，患者腹水細(xì)胞釋放高水平的外泌體。H）來自同一患者的原發(fā)性卵巢腫瘤組織（OT），腹水(Asc)和轉(zhuǎn)移組織(Met)中的pSTAT3表達(dá)顯示腹水和轉(zhuǎn)移部位與原發(fā)腫瘤部位相比STAT3活化增加。I）在從EpCam表達(dá)正常化的患者腹水中分離的外泌體中證實(shí)了癌蛋白例如STAT3，pSTAT3和FAS的表達(dá)。J）遷移實(shí)驗(yàn)使用從STAT3 WT和STAT3 KD細(xì)胞分離的外泌體證明了外泌體STAT3對OVCAR8細(xì)胞遷移有重要作用。
5.使用原位卵巢腫瘤模型評估HEx在體內(nèi)的腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移潛能
Figure 5
圖5HEx增強(qiáng)腫瘤轉(zhuǎn)移并能重新編程正常細(xì)胞 A）B）在與NEx和HEx共同培養(yǎng)3周后，用POCC（原發(fā)性卵巢癌細(xì)胞）外泌體處理的OVCAR8細(xì)胞注射小鼠卵巢囊。與注射OVCAR8 NEx的對照小鼠相比，注射OVCAR8 HEx的小鼠腫瘤重量顯著增加。C）D）注射與HEx共培養(yǎng)的OVCAR8細(xì)胞的小鼠中的轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)的數(shù)目顯著高于注射與NEx共培養(yǎng)的OVCAR8細(xì)胞。E）在注射了輸卵管分泌細(xì)胞的小鼠中進(jìn)行了類似的實(shí)驗(yàn)，這些細(xì)胞與NEx和HEx共同培養(yǎng)后沒有觀察到腫瘤，但與HEx共同培養(yǎng)的輸卵管形態(tài)發(fā)生顯著變化。F）與NEx或?qū)φ战M相比，HEx組卵巢的輸卵管重量顯著增加。G）（i）注射永生化FT細(xì)胞的對照小鼠輸卵管（FT）的蘇木精和伊紅（H＆E）染色切片，其表面上皮和由基質(zhì)隔開的腺體可見，沒有細(xì)胞異型性；（ii）注射HEx處理的FT細(xì)胞后，有上皮細(xì)胞增殖，沒有介入基質(zhì)，非典型多形核被識別；（iii）注射永生化FT細(xì)胞的對照小鼠FT的Ki67染色與注射HEx處理的FT細(xì)胞小鼠后的（iv）FT切片相比顯示出不足的核標(biāo)記。H）使用針對Ki67（綠色）/ CK8（紅色）和ki67（綠色）/ CD31（紅色）（箭頭表示共定位）的單克隆抗體，在正常和HEx處理的輸卵管的冷凍組織切片中進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)記，Hoechst 3342染色顯示所有細(xì)胞核。I）和對照組相比，注射HEx共培養(yǎng)的FT細(xì)胞的小鼠FT組織切片的免疫熒光染色合并通道顯示，IL-6（DAPI-藍(lán)色/ IL-6-紅色）和pSTAT3（DAPI-藍(lán)色/ pSTAT3-紅色）表達(dá)水平的增加。
6.HEx對卵巢癌細(xì)胞耐藥性的影響
Figure 6
圖6 HEx參與化療抗性 A）比較卵巢癌控制（順鉑治療之前）、順鉑敏感性（治療后6個月無復(fù)發(fā)）和順鉑耐藥性（治療后6個月復(fù)發(fā)）的患者樣本，發(fā)現(xiàn)順鉑治療后，血清外泌體的濃度顯著增加。B）在常氧和缺氧條件下培養(yǎng)不同的卵巢癌細(xì)胞系，用ICP-MS測量順鉑處理后外泌體中順鉑的濃度，結(jié)果顯示缺氧時順鉑外排明顯增加。C）磺酰羅丹明測定法測定結(jié)果顯示，與對照組相比，OVCAR8細(xì)胞和Hex共培養(yǎng)后細(xì)胞增殖百分比增加。D）E）與未經(jīng)任何外泌體處理的OVCAR8細(xì)胞相比，經(jīng)HEx預(yù)處理的OVCAR8細(xì)胞用順鉑處理24小時后，?H2Ax陽性細(xì)胞增加。F）與未經(jīng)外泌體處理的OVCAR8細(xì)胞相比，經(jīng)HEx處理的OVCAR8細(xì)胞中C-PARP、CC-3和CC-7的凋亡蛋白表達(dá)降低。泳道：1（對照），泳道：2（DMSO），泳道3（HO3867-10μM，STAT3抑制劑），泳道4（順鉑-10μM），泳道5（HO3867 + CP）。G）NTA定量測定結(jié)果顯示，缺氧條件下OVCAR8細(xì)胞的外泌體濃度經(jīng)阿米洛利處理后顯著降低。H）共聚焦顯微鏡觀察到，在缺氧條件下用阿米洛利處理的OVCAR8細(xì)胞與用順鉑處理的OVCAR8細(xì)胞相比，溶酶體的外周定位減少。I）J）OVCAR8細(xì)胞的細(xì)胞存活數(shù)量和集落形成分析表明，與對照組相比，阿米洛利單獨(dú)治療時沒有細(xì)胞毒性，但與順鉑一起治療時，細(xì)胞毒性效應(yīng)增加。
結(jié)論
在卵巢癌細(xì)胞中敲減STAT3會減少外泌體釋放，這一作用是通過在低氧條件下改變Rab家族蛋白Rab7和Rab27a來實(shí)現(xiàn)的。低氧條件下培養(yǎng)的來自患者腹水的卵巢癌細(xì)胞系分泌的外泌體攜帶更有效的致癌蛋白STAT3和FAS，能夠顯著增加細(xì)胞遷移/侵襲和體外化學(xué)耐受性以及體內(nèi)腫瘤進(jìn)展/轉(zhuǎn)移。HEx能夠精確地重新排列無限增殖的輸卵管分泌上皮細(xì)胞（FT），使其在小鼠輸卵管中變成促致癌細(xì)胞。此外，在低氧條件下，通過外泌體的順鉑外排在卵巢癌細(xì)胞中顯著增加。 HEx與腫瘤細(xì)胞的共培養(yǎng)導(dǎo)致雙鏈DNA損傷顯著減少并且影響對順鉑治療的應(yīng)答而增加細(xì)胞存活。通過已知抑制劑阿米洛利或STAT3抑制劑阻斷外泌體的釋放并用順鉑處理導(dǎo)致細(xì)胞凋亡顯著增加，減少集落形成和擴(kuò)散。
圖7低氧卵巢癌細(xì)胞示意圖，表示STAT3介導(dǎo)的外泌體釋放信號級聯(lián)有助于轉(zhuǎn)移和化學(xué)反應(yīng)，并且還顯示了用于標(biāo)準(zhǔn)化療干預(yù)措施的有希望的檢查點(diǎn)（綠色條）。