脂肪細(xì)胞衍生的外泌體miR-27a通過抑制PPARγ在骨骼肌中誘導(dǎo)胰島素抵抗
Theranostics: 脂肪細(xì)胞衍生的外泌體miR-27a通過抑制PPARγ在骨骼肌中誘導(dǎo)胰島素抵抗
脂肪細(xì)胞衍生的內(nèi)分泌因素促進(jìn)骨骼肌胰島素抵抗的機(jī)制尚未完全了解。miR-27a在前驅(qū)糖尿病和T2DM肥胖患者的血清中高度表達(dá)，主要由脂肪組織衍生。因此，由脂肪組織分泌到循環(huán)中的miR-27a可以調(diào)節(jié)骨骼肌中的胰島素抵抗。近日，發(fā)表在《Theranostics》（IF:8.766）的文章《Adipocyte-Derived Exosomal MiR-27a Induces Insulin Resistance in Skeletal Muscle Through Repression of PPARγ》探究了在肥胖幼年高脂飲食誘導(dǎo)的miR-27a敲減肥胖小鼠，db/db小鼠和過表達(dá)miR-27a的C2C12細(xì)胞中miR-27a與骨骼肌胰島素抵抗之間的關(guān)聯(lián)。通過棕櫚酸酯處理的3T3-L1脂肪細(xì)胞制備的條件培養(yǎng)基孵育C2C12細(xì)胞來測定外泌體miR-27a介導(dǎo)的脂肪組織和骨骼肌之間的信號通訊。研究人員發(fā)現(xiàn)肥胖幼年小鼠血清miR-27a水平與肥胖和胰島素抵抗呈正相關(guān)，并且血清miR-27a水平與瘦素受體缺陷型db/db小鼠的胰島素抵抗和肥胖和胰島素抵抗相關(guān)，同時與高脂飲食喂養(yǎng)的C57BL/6J小鼠肥胖和胰島素抵抗相關(guān)。從高脂飲食喂養(yǎng)的C57BL/6J小鼠的脂肪細(xì)胞釋放的miR-27a與甘油三酯積累有關(guān)。來源于這些脂肪細(xì)胞的miR-27a通過miR-27a介導(dǎo)的對PPARγ及其下游基因的抑制來參與肥胖發(fā)展，在C2C12骨骼肌細(xì)胞中誘導(dǎo)胰島素抵抗。
技術(shù)路線
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1、 血清中miR-27a水平與肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗有關(guān)
圖一 血清miR-27a與肥胖兒童進(jìn)行性全身胰島素抵抗有關(guān)，并且在高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠和db / db（瘦素受體缺陷型）小鼠中血清miR-27a水平升高。
A) 肥胖（OB）和正常體重（NW）兒童的血清中的miR-27a水平，miR-27a在肥胖兒童的血清中升高；
B）血清miR-27a水平與BMI之間的相關(guān)性；
C）血清miR-27a水平與空腹血糖之間的相關(guān)性；
D）HF（高脂飲食）和LF（低脂飲食）喂養(yǎng)的小鼠2、4、8和12周時體脂肪分布百分比；
E）HF和LF組血清中miR-27a的相對表達(dá)；
F）HF組和LF組OGTT（口服葡萄糖耐量試驗(yàn)）曲線下面積；
G）HF組和LF組ITT（胰島素耐量試驗(yàn)）曲線下面積；
I）db / db小鼠的Lee’s指數(shù)顯著高于db / m小鼠；
J）db / db小鼠的空腹血糖顯著高于db / m小鼠；
K）db / db小鼠血清中miR-27a的相對表達(dá)顯著高于db / m小鼠；
L）db / m和db / db小鼠的OGTT曲線下面積。
圖二 在高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠中，敲減miR-27a降低了血清miR-27a水平并且改善了葡萄糖和胰島素耐受性，但是不提高體脂肪百分比分布。
A）低脂飲食+空載體小鼠（LF + EV），高脂飲食+空載體小鼠（HF + EV）和高脂飲食+ miR-27a敲減小鼠的脂肪百分比；
B）各組血清miR-27a的相對表達(dá)，其中高脂飲食+空載體小鼠表達(dá)量最高；
C）各組OGTT曲線下面積，與LF+EV組相比，HF+EV和HF+miR-27a(-)都更高；
D）各組ITT曲線下面積，與HF+EV相比，HF+EV和HF+miR-27a(-)顯著升高。
2、 MiR-27a通過PPARγ抑制作用損害骨骼肌中的胰島素信號傳導(dǎo)
圖三 miR-27a促進(jìn)骨骼肌中的胰島素抵抗。
A）第2、4、8、12周LF和HF小鼠骨骼肌中的miR-27a水平；
B）12周時LF和HF小鼠中IRS-1，Akt和GLUT4的mRNA表達(dá)；
C）12周時用胰島素處理（+）或未處理（-）的LF和HF小鼠骨骼肌中p-IRS-1，IRS-1，p-Akt，Akt和GAPDH的蛋白質(zhì)表達(dá)；
D）LF + EV，HF + EV和HF + miR-27a（-）小鼠骨骼肌中miR-27a水平；
E）LF + EV，HF + EV和HF + miR-27a（-）小鼠中IRS-1，Akt和GLUT4的mRNA表達(dá)；
F）LF + EV，HF + EV和HF + miR-27a（-）小鼠骨骼肌中p-IRS-1，IRS-1，p-Akt，Akt和GAPDH的蛋白質(zhì)表達(dá)。
圖四 miR-27a通過靶向PPARγ來減少C2C12細(xì)胞中的葡萄糖消耗。
A）對照（黑色），miR-27a（+）（空白），miR-27a +羅格列酮（灰色）和羅格列酮（陰影）C2C12細(xì)胞中miR-27a的表達(dá)；
B）上述C2C12細(xì)胞中的葡萄糖消耗；
C）用（+）或不用（-）100nM胰島素溫育30分鐘的上述C2C12細(xì)胞中的葡萄糖攝取。與與對照相比，胰島素刺激未能增加miR-27a（+）細(xì)胞中的葡萄糖攝??；
D）通過預(yù)測靶掃描，mmu-miR-27a-3p和PPARγ3'UTR的318-325位的序列互補(bǔ)；
E）miR-27a和PPARγ的熒光素酶報道試驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-27a通過與野生型PPARγ3'UTR序列結(jié)合顯著降低熒光素酶密度，而突變型PPARγ3'UTR沒有發(fā)現(xiàn)減少。
圖五 miR-27a通過PPARγ抑制作用損害骨骼肌中胰島素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
A-C）PPARγ在12周LF和HF小鼠骨骼肌中的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，與LF小鼠相比，HF小鼠骨骼肌中PPARγ的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)較低；
D-F）LF + EV，HF + EV和HF + miR-27a（-）小鼠骨骼肌中PPARγ的mRNA和蛋白表達(dá)，HF小鼠中miR-27a敲減增加了PPARγ的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)；
G-J）羅格列酮治療部分增加過表達(dá)miR-27a的細(xì)胞中的PPARγmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)；
K-L）羅格列酮治療增加了過表達(dá)miR-27a的細(xì)胞中胰島素刺激的p-IRS-1蛋白及其下游p-Akt蛋白表達(dá)。
3、 負(fù)載脂質(zhì)的脂肪細(xì)胞（但不是巨噬細(xì)胞）會將miR-27a分泌到外泌體中
圖六 HF飲食喂養(yǎng)的小鼠的脂肪細(xì)胞釋放miR-27a，棕櫚酸酯處理的3T3-L1脂肪細(xì)胞分泌miR-27a。
A）LF和HF小鼠在2,4,8和12周的內(nèi)臟脂肪組織中miR-27a的相對表達(dá)，與LF喂養(yǎng)的小鼠相比，喂食高脂肪飲食2周的小鼠的內(nèi)臟脂肪組織中的MiR-27a表達(dá)增加；
B）db / m和db / db小鼠的內(nèi)臟脂肪組織中miR-27a的相對表達(dá)，與db / m小鼠相比，db / db小鼠在內(nèi)臟脂肪中表現(xiàn)出miR-27a的較低表達(dá)；
C）LF + EV，HF + EV和HF + miR-27a（-）小鼠的內(nèi)臟脂肪組織中的miR-27a水平，在喂食HF的小鼠中miR-27a敲減導(dǎo)致內(nèi)臟脂肪組織中miR-27a水平降低；
D-F）與對照（Con）相比，在棕櫚酸鹽處理的細(xì)胞（Pal）中觀察到脂質(zhì)積累的增加, TAG濃度也增加；
G）與對照相比，棕櫚酸酯處理的3T3-L1細(xì)胞中的miR-27a表達(dá)較低；
H）棕櫚酸鹽處理的細(xì)胞上清液中miR-27a水平比對照細(xì)胞高2.7倍。
圖七 負(fù)載脂質(zhì)的脂肪細(xì)胞衍生的miR-27a在外泌體中分泌。
A）在2,4,8和12周的LF和HF小鼠的血清中的FABP4濃度；
B -C）與LF小鼠相比，血清外泌體為FABP4陽性，并且來自HF小鼠血清的這些外泌體中的miR-27a積累較高；
D）從對照或棕櫚酸處理的表達(dá)miR-27a的3T3-L1細(xì)胞上清液中提取的外泌體中的MiR-27a水平。與對照相比，用棕櫚酸酯處理3T3-L1細(xì)胞將miR-27a釋放到上清液中；
E）在用棕櫚酸鹽處理的過表達(dá)miR-27a的3T3-L1細(xì)胞的上清液中，miR-27a與FABP4共定位；
F）在不存在或存在0.3mM棕櫚酸酯的情況下溫育48小時的來自3T3細(xì)胞的外泌體的掃描電子顯微照片；
G）外泌體標(biāo)記物CD63存在上述細(xì)胞中；
H）上述細(xì)胞外泌體中miR-27a的表達(dá)，棕櫚酸酯處理后表達(dá)增強(qiáng)。
4、 脂肪細(xì)胞衍生的外泌體miR-27a被C2C12骨骼肌細(xì)胞攝取
圖八 C2C12細(xì)胞攝取脂肪細(xì)胞分泌的外泌體miR-27a。
A）與LF小鼠相比，HF的骨骼肌裂解物中FABP4蛋白的表達(dá)增加；
B）在C2C12細(xì)胞與CM1（對照）或CM2（棕櫚酸酯處理）培養(yǎng)基孵育48小時后，上清液中的FABP4降低；
C）與CM1或CM2孵育后C2C12細(xì)胞中的FABP4濃度；
D）在C2C12細(xì)胞與CM1或CM2培養(yǎng)基孵育48小時后，上清液中miR-27a水平降低；
E）在用對照或棕櫚酸處理的3T3-L1細(xì)胞（其中miR-27a被敲除）制備的條件培養(yǎng)基中，與CM1相比，CM2孵育的C2C12細(xì)胞中miR-27a水平升高；
F）與對照相比，用棕櫚酸酯處理的脂肪細(xì)胞的上清液孵育的C2C12中的熒光強(qiáng)度更大。
5、 脂肪細(xì)胞衍生的miR-27a在骨骼肌細(xì)胞中積累，并且通過阻抑PPARγ而損害胰島素信號傳導(dǎo)
圖九 脂肪細(xì)胞衍生的miR-27a增加miR-27a，并且損害C2C12細(xì)胞中的胰島素信號傳導(dǎo)。
A-B）與CM1處理的細(xì)胞相比，CM2處理的C2C12細(xì)胞的葡萄糖消耗，葡萄糖攝取和胰島素刺激的葡萄糖攝取降低；
C-D）與CM1組相比，CM2組中觀察到PPARγmRNA和蛋白質(zhì)水平的明顯降低，CM1組通過CM2組中的miR-27a敲減而恢復(fù)；
E-F）與CM1處理的細(xì)胞相比，CM2處理的C2C12細(xì)胞中PPARγ，IRS-1和GLUT4mRNA表達(dá)降低，并且胰島素刺激的p-IRS-1和p-AKT降低。
結(jié)論
綜上所述，這些結(jié)果確定了脂肪組織和骨骼肌之間在胰島素抵抗發(fā)展過程中的新型交叉通訊信號通路，并且表明脂肪組織來源的miR-27a可能在肥胖引發(fā)的骨骼肌胰島素抵抗發(fā)生中起關(guān)鍵作用。