S期富集lncRNA的泛癌分析可鑒定致癌因子和生物標(biāo)志物
盡管近年來(lái)的研究使我們對(duì)長(zhǎng)非編碼RNA (lncRNAs)在癌癥中的作用有了初步的了解，目前還沒(méi)有找到與臨床相關(guān)的lncRNA。2018年2月末，來(lái)自瑞典薩爾格學(xué)院的由醫(yī)學(xué)生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)教授Chandrasekhar Kanduri領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)在Nature Communications(IF= 12.353)上發(fā)表了題為“PAN-cancer analysis of S-phase enriched lncRNAs identifies oncogenic drivers and biomarkers”的新成果。研究人員通過(guò)降低一種特定RNA分子的活性治療患肺癌的小鼠，治愈率達(dá)到40%至50%。
該研究提供了一個(gè)基于S期相關(guān)的lncRNA中具有潛在預(yù)后價(jià)值的致癌因子或腫瘤標(biāo)志物的綜合性列表。本文利用新生RNA的捕獲測(cè)序技術(shù)，鑒定了1145個(gè)在S期表達(dá)豐富的lncRNAs。其中，通過(guò)與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)交叉分析篩選出至少在一種腫瘤類型中表達(dá)差異顯著的570個(gè)lncRNAs。系統(tǒng)性臨床調(diào)查14例泛癌資料，鑒定出了633個(gè)新型的的預(yù)后標(biāo)志物。在幾個(gè)癌癥模型中，沉默頂層差異表達(dá)以及與臨床相關(guān)的S期富集lncRNAs（主要檢測(cè)了8個(gè)）會(huì)影響關(guān)鍵的癌細(xì)胞特征。在多種癌癥類型中對(duì)SCAT7的功能與機(jī)制研究表明，它與hnRNPK/YBX1復(fù)合物相互作用，通過(guò)FGF/FGFR及其下游PI3K/AKT和MAPK通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志物。該研究了一種基于LNA反義寡核苷酸的治療癌癥細(xì)胞系和患者源性腫瘤(PDX)異種移植的策略。
技術(shù)路線：
結(jié)果:
1.鑒定跨S期表達(dá)的lncRNA 及其在腫瘤中的差異表達(dá)
圖1：利用新生RNA捕獲測(cè)序鑒定S期表達(dá)的lncRNA。a. 新生RNA捕獲在S期的三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞周期圖。b. lnRNA的表達(dá)譜的主成分分析(PCA)。c.通過(guò)STEM聚類分析，S期的lncRNA顯示了四種顯著的時(shí)間模式。維恩圖顯示了EtU標(biāo)記和未標(biāo)記樣本富集的lncRNA的交叉分析。d. S期富集的lncRNA附近的(< 50kb)蛋白編碼基因分子信號(hào)通路分析(左圖)和GO富集分析（右圖）。
2. S期相關(guān)的lncRNAs展示出的后生性的變化以及表征為獨(dú)立的預(yù)后標(biāo)志物
圖2:使用泛癌TCGA數(shù)據(jù)集將S期相關(guān)的lncRNAs表征為致癌驅(qū)動(dòng)因子和獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物。a.在至少一種腫瘤類型中（通過(guò)與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)）存在顯著差異的表達(dá)的S期相關(guān)的570個(gè)lncRNA。b.維恩圖揭示了S期相關(guān)的lncRNA在不同類型的腎癌和肺癌中差異性表達(dá)交叉分析。c.抵抗啟動(dòng)子甲基化相關(guān)的S期lncRNA在不同癌癥類型中差異表達(dá)狀態(tài)。d.熱圖顯示了基于二分法的520個(gè)S期lncRNA潛在獨(dú)立預(yù)后價(jià)值。e.維恩圖顯示了s期lncRNA的數(shù)量，它們可以獨(dú)立地預(yù)測(cè)不同類型的腎癌和肺癌的生存狀況。
3. SCATs調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程與細(xì)胞凋亡
圖3：臨床相關(guān)性最高的S期lncRNA調(diào)控關(guān)鍵的腫瘤標(biāo)志物。a.SCAT1-SCAT8的Kaplan-Meier圖顯示了KIRC患者的總體生存率。b,c,d.使用兩種不同的LNAs或siRNAs敲低SCATs， SCATs沉默48小時(shí)后HeLa細(xì)胞的增殖能力，細(xì)胞周期以及caspase 3/7活性檢測(cè)。e.Caki-2 (KIRC)細(xì)胞的MTT分析。f,g.Caki-2細(xì)胞用不同的LNAs或siRNA敲低后的細(xì)胞周期分布以及caspase 3/7活性。
4. SCAT1和SCAT5分別作為獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)
圖4：SCAT1和SCAT5分別作為肺癌和腎源性癌癥的致癌因素和預(yù)后指標(biāo)。a.條形圖顯示了從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的10種不同癌癥類型中SCAT1的顯著差異表達(dá)水平。b.SCAT1的Kaplan-Meier圖揭示了LUAD和LUSC)型患者的總體生存率。c,d,e.敲低SCAT1的MTT細(xì)胞增殖分析,細(xì)胞周期狀況以及caspase 3/7活性。f.條形圖顯示了SCAT5在從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的5種不同癌癥類型中顯著的差異表達(dá)水平。g.SCAT5的Kaplan-Meier圖顯示了KICH和KIRP腎癌患者的總體生存率。h,I,j.對(duì)SCAT5沉默的Caki-2細(xì)胞系的MTT增殖分析,細(xì)胞周期分析以及caspase 3/7的活性。
5. SCAT7調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志物，下調(diào)SCAT7的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞衰老
圖5：SCAT7是腎臟、肺和肝癌的致癌因子。a.SCAT7在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中不同的癌癥類型之間表達(dá)呈log2的倍數(shù)變化。b,c.敲低SCAT7的 Caki-2, A549，和HepG2細(xì)胞的MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞的細(xì)胞周期分布。d,e,f.g.Caki-2和A549 中SCAT7沉默的48h后凋亡細(xì)胞的百分比以及細(xì)胞的遷移和Matrigel細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)以及軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)。h.HeLa, Caki-2和A549細(xì)胞過(guò)表達(dá)SCAT7的MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。I,j.β-半乳糖苷酶比色檢測(cè)使用三種siRNAs沉默72h后。計(jì)量衰老細(xì)胞占整個(gè)細(xì)胞群的百分比。k.連續(xù)傳代的BJ-BRAF細(xì)胞的SCAT7的qPCR。i. SCAT7在其莫西芬(200 nM)誘導(dǎo)的衰老第0天和第3天的BJ-BRAF細(xì)胞在一定時(shí)間間隔里的表達(dá)。m.過(guò)表達(dá)SCAT7的BJ-BRAF細(xì)胞用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖。n,o,p，q.檢測(cè)接受他莫西芬治療3天后的陽(yáng)性衰老細(xì)胞的百分比并p16、p15(o)和IL8 (p)的表達(dá)。
6. SCAT7調(diào)控FGF/FGFR, PI3K/AKT, and Ras/MAPK等多種信號(hào)通路。
圖6：SCAT7通過(guò)FGF信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞增殖。a – c,d.在HeLa (a)、Caki-2 (b)和A549 (c)細(xì)胞系中敲低SCAT7后，通過(guò)熱圖揭示了在相應(yīng)分子通路和生物過(guò)程的上調(diào)和下調(diào)基因。Western blot檢測(cè)蛋白水平。e.實(shí)時(shí)熒光定量qPCR(左面板)和Western blot(右面板)檢測(cè)到CCND1的表達(dá)水平顯著降低。f.qPCR驗(yàn)證分別利用siRNAs或shRNA敲低的SCAT7及其靶基因的表達(dá)水平，g.過(guò)表達(dá)SCAT7檢測(cè)SCAT7及其靶基因FGFR2在HeLa和Caki-2細(xì)胞中的表達(dá)。h,iFGFR3沉默后進(jìn)行MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)并檢測(cè)細(xì)胞周期表達(dá)譜。
7. SCAT7/hnRNPK/YBX1復(fù)合體調(diào)控腫瘤標(biāo)志物
圖7：SCAT7與hnRNPK和YBX1互作，調(diào)控細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程。a.維恩圖對(duì)HeLa細(xì)胞中的SCAT7相互作用的蛋白的交叉分析。b. RNA免疫印跡實(shí)驗(yàn)（RIP）后qPCR檢測(cè)SCAT7。c.免疫印跡驗(yàn)證SCAT7與hnRNPK和YBX1的相互作用。d.轉(zhuǎn)染兩個(gè)靶向hnRNPK或YBX1的siRNA后進(jìn)行細(xì)胞周期分析。e，f.檢測(cè)FGFR2在敲低hnRNPK和YBX1的HeLa細(xì)胞中的表達(dá)。g.Western blot檢測(cè)hnRNPK和YBX1沉默的HeLa細(xì)胞中標(biāo)志物的表達(dá)。
8. SCAT7是腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)
圖8：SCAT7是不同類型的腫瘤潛在治療靶點(diǎn)。a.在Balb / c裸鼠皮下注射1×106 Csh或SCAT7-sh2 786 - o細(xì)胞后8周檢測(cè)腫瘤生長(zhǎng)狀況(每組n = 8)。b.在Balb / c裸鼠皮下注射1×106 Csh或SCAT7-sh1和SCAT7-sh2的 A549細(xì)胞8周后檢測(cè)腫瘤生長(zhǎng)狀況(每組n = 6)。c.對(duì)Balb/c裸鼠進(jìn)行4次皮下注射，檢測(cè)腫瘤生長(zhǎng)抑制(TGI)作用(每組n = 5)。e. qPCR檢測(cè)Ctrl-LNA、SCAT7- LNA1、SCAT7- LNA2處理A549腫瘤后的表達(dá)SCAT7。f.散點(diǎn)圖揭示體內(nèi)SCAT7的表達(dá)與腫瘤體積的相關(guān)性。h.對(duì)NSG小鼠進(jìn)行人源腫瘤異體移植模型(PDX)， i.用SCAT7 LNAs處理的PDX模型的平均腫瘤生長(zhǎng)體積。j, k模型描述SCAT7 (k)在FGF/FGFR信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制。
參考文獻(xiàn)：Ali MM1, Akhade VS1, Kosalai ST1, Subhash S1, Statello L1, Meryet-Figuiere M1, Abrahamsson J2, Mondal T1, Kanduri C3. PAN-cancer analysis of S-phase enriched lncRNAs identifies oncogenic drivers and biomarkers. Nat Commun. 2018 Feb 28;9(1):883.