miR-134以PDCD7為靶標減少E-鈣黏蛋白的表達從而加速口腔癌的進程

miR-134在惡性腫瘤轉(zhuǎn)化中的功能作用是復(fù)雜且有爭議的。7月4日，中國臺灣國立陽明大學(xué)的學(xué)者在 International Journal of Cancer（IF= 7.360）雜志發(fā)表了題為“miR-134 targets PDCD7 to reduce E-cadherin expression and enhance oral cancer progression”的論文，該論文闡明了miR-134在口腔鱗狀細胞癌（OSCC）中的致癌作用。使用野生型和突變體構(gòu)建體的報告分析證實，程序性細胞死亡7（PDCD7）基因是miR-134的潛在靶標。外源表達miR-134降低OSCC細胞中PDCD7表達，外源性表達miRZip-134增加OSCC細胞中PDCD7的表達；另外，PDCD7表達抑制了OSCC細胞的致癌性。通過基因編輯技術(shù)敲除PDCD7增加了裸鼠體外致癌性和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并降低了E-鈣粘蛋白（E-cad）的表達。PDCD7通過啟動子中的GC盒反式激活E-cad表達。此外，PDCD7減弱了miR-134相關(guān)的細胞轉(zhuǎn)化和E-cad下調(diào)。在OSCC腫瘤組織中觀察到PDCD7和E-cad的下調(diào)和高水平的miR-134表達。miR-134-PDCD7-E-cad 發(fā)病機制級聯(lián)的激活發(fā)生在人和小鼠口腔癌變的早期階段。總之，miR-134在口腔癌中的致癌作用是通過降低PDCD7和E-cad的表達來介導(dǎo)的。

技術(shù)路線：

研究結(jié)果：

1. miR-134在OSCC細胞中以PDCD7為靶點

圖1. miR-134在OSCC細胞中靶向PDCD7。（a）外源miR-134在OSCC細胞亞克隆中表達。（b，c）外源miR-134穩(wěn)定表達增加了OSCC細胞的生長和遷移。（d，e）外源miR-134瞬時表達增加了BrdU標記的細胞群和OSCC細胞的侵襲。（f，g）外源miRZip-134表達抑制OECM1細胞的增殖和遷移。（h，i）miR-134對PDCD7的3'UTR的作用導(dǎo)致WtR細胞中PDCD7活性降低; 然而，PDCD7活性在MutR的細胞中恢復(fù)。（j）外源miR-134表達降低OSCC細胞中的PDCD7表達，而miRZip-134表達增加OECM1細胞中的PDCD7表達。（k）OSCC細胞系中miR-134，PDCD7和E-cad表達的分析。（l）Heatmap blot，OSCC細胞系中miR-134，PDCD7和E-cad表達之間的相關(guān)性。

2. PDCD7抑制OSCC細胞的增殖和遷移，miR-134- PDCD7調(diào)控E-cad表達

圖2. miR-134下調(diào)OSCC細胞中PDCD7和E-cad的表達。（a）外源表達PDCD7抑制OECM1細胞的生長（上圖），BrdU標記的細胞群（中圖）和遷移（下圖）。（b，c）左圖，細胞生長測定;右圖，遷移試驗。（d-g）WB分析。（h）免疫熒光。（b，h）OECM1細胞;（c）FaDu細胞;（d，e）OECM1和FaDu細胞;（f，g）OECM1和SAS細胞。（b）外源性PDCD7在對照和表達miR-134的OECM1細胞中的表達。（c）外源性PDCD7在對照和表達miR-134的FaDu細胞中的表達。（d）外源miR-134表達降低OSCC細胞中的PDCD7和E-cad表達。（e）miR-134抑制劑處理時增加OSCC細胞中的PDCD7和E-cad表達。miR-134調(diào)節(jié)的β-連環(huán)蛋白和波形蛋白的變化不一致。（f）外源性PDCD7表達增加OSCC細胞中的E-cad表達。（g）外源性PDCD7表達可恢復(fù)mi-134介導(dǎo)的對E-cad的抑制。（h）OECM1細胞主要在細胞核中觀察到內(nèi)源性和外源性PDCD7免疫熒光。

3.敲除PDCD7增加OSCC細胞的遷移并減少E-cad表達

圖3. 敲除PDCD7增加了OSCC細胞致癌表型并降低E-cad表達。對OECM1細胞和SAS細胞及其敲除PDCD7細胞亞克隆進行分析。（a，c）OECM1細胞;（b，d，e）SAS細胞;（f - h）OECM1和SAS細胞。（a，b）上圖，細胞生長測定;下圖，典型的倒置顯微鏡圖像。（c，d）上圖，遷移試驗;下圖，在transwell膜下表面使用DAPI標記的細胞核的代表性圖像。DAPI，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，二鹽酸鹽。（e）侵襲試驗。對SAS細胞及其敲除PDCD7的細胞亞克隆進行分析。（f）qRT-PCR分析以檢測E-cad的mRNA表達。（g，h）蛋白質(zhì)印跡分析。敲除PDCD7后E-cad和活性β-連環(huán)蛋白表達降低；外源表達PDCD7后E-cad表達增加。除了SPDCD7 CR 2-4之外，所有細胞亞克隆中均觀察到外源表達PDCD7后β-連環(huán)蛋白的表達增加。

4. PDCD7通過調(diào)控GC-Box增加E-cad啟動子活性

圖4.E-cad啟動子報告基因測定和ChIP測定。（a-d）野生型E-cad啟動子報告基因測定。（e）E-cad啟動子中缺失報告基因構(gòu)建體的示意圖。（f）檢測缺失構(gòu)建體。（a，b，d - h）OECM1細胞。（c）FaDu細胞。（a，f）外源性表達PDCD7。（b）表達miR-134。（c）抑制miR-134。（d）敲除PDCD7。（g，h）ChIP測定。（g）PCR產(chǎn)物的凝膠電泳圖像。（h）ChIP qPCR分析。

5. miR-134-PDCD7-E-cad在小鼠口腔癌中的激活

圖5. miR-134-PDCD7-E-cad致癌軸在小鼠化學(xué)致癌模型和原位頸部轉(zhuǎn)移模型中的調(diào)節(jié)。（a - d，f）4NQO誘導(dǎo)的小鼠舌腫瘤發(fā)生模型。（g -i）NOD-SCID小鼠的原位頸部轉(zhuǎn)移模型。（a）與未處理的對照組織相比，癌前病變（16周）和腫瘤病變（28周）中的miR-134染色和PDCD7和E-cad免疫反應(yīng)性。對照組織，×100;病變組織，×200。（b-d）miR-134，PDCD7和E-cad定量分析。（e）在各種OSCC細胞系中，用4NQO處理均增加miR-134表達。（F）Heatmap blot表明小鼠口腔組織中miR-134，PDCD7和E-cad之間表達的相關(guān)性。（g）來自SAS細胞或SPDCD7 CR2-2細胞亞克隆的舌癌和頸部淋巴結(jié)病變原發(fā)腫瘤的典型病理組織學(xué)切片。虛線環(huán)繞頸部轉(zhuǎn)移病灶。（h，i）腫瘤體積的定量（左圖）和轉(zhuǎn)移率（右圖）。（h）所有腫瘤。（i）腫瘤大小< 10 mm³。

6. miR-134-PDCD7-E-cad在人類OSCC中的激活

圖6. miR-134-PDCD7-E-cad在人類OPMD和OSCC組織中的狀態(tài)。（a，b）OPMD。 （c - g）OSCC。（a，c）miR-134染色和PDCD7和E-cad在OPMD和OSCC組織陣列中的免疫反應(yīng)性。上圖，病變表現(xiàn)出強miR-134染色和相對較低的PDCD7和ECAD免疫反應(yīng);下圖，病變表現(xiàn)出弱miR-134染色和相對較高的PDCD7和E-cad免疫反應(yīng)。OPMD，× 200; OSCC，× 100。（b）左圖，miR-134，PDCD7和E-cad定量分析。中圖，heatmap blot表明OPMD中miR-134，PDCD7和E-cad表達之間的相關(guān)性。右圖，PDCD7與E-cad表達的相關(guān)性分析。（d）OSCC組織陣列中miR-134，PDCD7和E-cad評分前后圖。（e）左圖和（f）heatmap blot分別說明OSCC組織陣列中miR134/PDCD7/E-cad表達之間的相關(guān)性，以及miR134/PDCD7/E-CAD/WWOX在組織對中的表達。（e）右圖，組織陣列中PDCD7和E-cad表達之間的相關(guān)性分析。（g）總生存期（左圖）和無病生存期（右圖）。比較具有高miR-134表達水平和低PDCD7或E-cad表達水平的OSCC腫瘤，以及具有相反表達譜的腫瘤。OS，整生存期；DFS，無病生存期。

結(jié)論：

該研究闡明了在口腔癌中miR-134靶向PDCD7以驅(qū)動致癌性，并且PDCD7反式激活E-鈣粘蛋白表達。在小鼠模型中，PDCD7的敲除增加了口腔癌異種移植物的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。 miR-134-PDCD7-E-cad調(diào)節(jié)軸的激活發(fā)生在口腔癌發(fā)生的早期階段。 這項工作顯示miR-134抑制和PDCD7誘導(dǎo)對口腔癌消除的潛力。

參考文獻：Shih-Yuan Peng , Hsi-Feng Tu, Cheng-Chieh Yang, Cheng-Hsien Wu,Chung-Ji Liu,Kuo-Wei Chang , Shu-Chun Lin. miR-134 targets PDCD7 to reduce E-cadherin expression and enhance oral cancer progression. International Journal of Cancer. 2018 Jul