miR-134以PDCD7為靶標(biāo)減少E-鈣黏蛋白的表達(dá)從而加速口腔癌的進(jìn)程

miR-134在惡性腫瘤轉(zhuǎn)化中的功能作用是復(fù)雜且有爭(zhēng)議的。7月4日，中國(guó)臺(tái)灣國(guó)立陽(yáng)明大學(xué)的學(xué)者在 International Journal of Cancer（IF= 7.360）雜志發(fā)表了題為“miR-134 targets PDCD7 to reduce E-cadherin expression and enhance oral cancer progression”的論文，該論文闡明了miR-134在口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）中的致癌作用。使用野生型和突變體構(gòu)建體的報(bào)告分析證實(shí)，程序性細(xì)胞死亡7（PDCD7）基因是miR-134的潛在靶標(biāo)。外源表達(dá)miR-134降低OSCC細(xì)胞中PDCD7表達(dá)，外源性表達(dá)miRZip-134增加OSCC細(xì)胞中PDCD7的表達(dá)；另外，PDCD7表達(dá)抑制了OSCC細(xì)胞的致癌性。通過(guò)基因編輯技術(shù)敲除PDCD7增加了裸鼠體外致癌性和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并降低了E-鈣粘蛋白（E-cad）的表達(dá)。PDCD7通過(guò)啟動(dòng)子中的GC盒反式激活E-cad表達(dá)。此外，PDCD7減弱了miR-134相關(guān)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化和E-cad下調(diào)。在OSCC腫瘤組織中觀察到PDCD7和E-cad的下調(diào)和高水平的miR-134表達(dá)。miR-134-PDCD7-E-cad 發(fā)病機(jī)制級(jí)聯(lián)的激活發(fā)生在人和小鼠口腔癌變的早期階段。總之，miR-134在口腔癌中的致癌作用是通過(guò)降低PDCD7和E-cad的表達(dá)來(lái)介導(dǎo)的。

技術(shù)路線：

研究結(jié)果：

1. miR-134在OSCC細(xì)胞中以PDCD7為靶點(diǎn)

圖1. miR-134在OSCC細(xì)胞中靶向PDCD7。（a）外源miR-134在OSCC細(xì)胞亞克隆中表達(dá)。（b，c）外源miR-134穩(wěn)定表達(dá)增加了OSCC細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移。（d，e）外源miR-134瞬時(shí)表達(dá)增加了BrdU標(biāo)記的細(xì)胞群和OSCC細(xì)胞的侵襲。（f，g）外源miRZip-134表達(dá)抑制OECM1細(xì)胞的增殖和遷移。（h，i）miR-134對(duì)PDCD7的3'UTR的作用導(dǎo)致WtR細(xì)胞中PDCD7活性降低; 然而，PDCD7活性在MutR的細(xì)胞中恢復(fù)。（j）外源miR-134表達(dá)降低OSCC細(xì)胞中的PDCD7表達(dá)，而miRZip-134表達(dá)增加OECM1細(xì)胞中的PDCD7表達(dá)。（k）OSCC細(xì)胞系中miR-134，PDCD7和E-cad表達(dá)的分析。（l）Heatmap blot，OSCC細(xì)胞系中miR-134，PDCD7和E-cad表達(dá)之間的相關(guān)性。

2. PDCD7抑制OSCC細(xì)胞的增殖和遷移，miR-134- PDCD7調(diào)控E-cad表達(dá)

圖2. miR-134下調(diào)OSCC細(xì)胞中PDCD7和E-cad的表達(dá)。（a）外源表達(dá)PDCD7抑制OECM1細(xì)胞的生長(zhǎng)（上圖），BrdU標(biāo)記的細(xì)胞群（中圖）和遷移（下圖）。（b，c）左圖，細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)定;右圖，遷移試驗(yàn)。（d-g）WB分析。（h）免疫熒光。（b，h）OECM1細(xì)胞;（c）FaDu細(xì)胞;（d，e）OECM1和FaDu細(xì)胞;（f，g）OECM1和SAS細(xì)胞。（b）外源性PDCD7在對(duì)照和表達(dá)miR-134的OECM1細(xì)胞中的表達(dá)。（c）外源性PDCD7在對(duì)照和表達(dá)miR-134的FaDu細(xì)胞中的表達(dá)。（d）外源miR-134表達(dá)降低OSCC細(xì)胞中的PDCD7和E-cad表達(dá)。（e）miR-134抑制劑處理時(shí)增加OSCC細(xì)胞中的PDCD7和E-cad表達(dá)。miR-134調(diào)節(jié)的β-連環(huán)蛋白和波形蛋白的變化不一致。（f）外源性PDCD7表達(dá)增加OSCC細(xì)胞中的E-cad表達(dá)。（g）外源性PDCD7表達(dá)可恢復(fù)mi-134介導(dǎo)的對(duì)E-cad的抑制。（h）OECM1細(xì)胞主要在細(xì)胞核中觀察到內(nèi)源性和外源性PDCD7免疫熒光。

3.敲除PDCD7增加OSCC細(xì)胞的遷移并減少E-cad表達(dá)

圖3. 敲除PDCD7增加了OSCC細(xì)胞致癌表型并降低E-cad表達(dá)。對(duì)OECM1細(xì)胞和SAS細(xì)胞及其敲除PDCD7細(xì)胞亞克隆進(jìn)行分析。（a，c）OECM1細(xì)胞;（b，d，e）SAS細(xì)胞;（f - h）OECM1和SAS細(xì)胞。（a，b）上圖，細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)定;下圖，典型的倒置顯微鏡圖像。（c，d）上圖，遷移試驗(yàn);下圖，在transwell膜下表面使用DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核的代表性圖像。DAPI，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，二鹽酸鹽。（e）侵襲試驗(yàn)。對(duì)SAS細(xì)胞及其敲除PDCD7的細(xì)胞亞克隆進(jìn)行分析。（f）qRT-PCR分析以檢測(cè)E-cad的mRNA表達(dá)。（g，h）蛋白質(zhì)印跡分析。敲除PDCD7后E-cad和活性β-連環(huán)蛋白表達(dá)降低；外源表達(dá)PDCD7后E-cad表達(dá)增加。除了SPDCD7 CR 2-4之外，所有細(xì)胞亞克隆中均觀察到外源表達(dá)PDCD7后β-連環(huán)蛋白的表達(dá)增加。

4. PDCD7通過(guò)調(diào)控GC-Box增加E-cad啟動(dòng)子活性

圖4.E-cad啟動(dòng)子報(bào)告基因測(cè)定和ChIP測(cè)定。（a-d）野生型E-cad啟動(dòng)子報(bào)告基因測(cè)定。（e）E-cad啟動(dòng)子中缺失報(bào)告基因構(gòu)建體的示意圖。（f）檢測(cè)缺失構(gòu)建體。（a，b，d - h）OECM1細(xì)胞。（c）FaDu細(xì)胞。（a，f）外源性表達(dá)PDCD7。（b）表達(dá)miR-134。（c）抑制miR-134。（d）敲除PDCD7。（g，h）ChIP測(cè)定。（g）PCR產(chǎn)物的凝膠電泳圖像。（h）ChIP qPCR分析。

5. miR-134-PDCD7-E-cad在小鼠口腔癌中的激活

圖5. miR-134-PDCD7-E-cad致癌軸在小鼠化學(xué)致癌模型和原位頸部轉(zhuǎn)移模型中的調(diào)節(jié)。（a - d，f）4NQO誘導(dǎo)的小鼠舌腫瘤發(fā)生模型。（g -i）NOD-SCID小鼠的原位頸部轉(zhuǎn)移模型。（a）與未處理的對(duì)照組織相比，癌前病變（16周）和腫瘤病變（28周）中的miR-134染色和PDCD7和E-cad免疫反應(yīng)性。對(duì)照組織，×100;病變組織，×200。（b-d）miR-134，PDCD7和E-cad定量分析。（e）在各種OSCC細(xì)胞系中，用4NQO處理均增加miR-134表達(dá)。（F）Heatmap blot表明小鼠口腔組織中miR-134，PDCD7和E-cad之間表達(dá)的相關(guān)性。（g）來(lái)自SAS細(xì)胞或SPDCD7 CR2-2細(xì)胞亞克隆的舌癌和頸部淋巴結(jié)病變?cè)l(fā)腫瘤的典型病理組織學(xué)切片。虛線環(huán)繞頸部轉(zhuǎn)移病灶。（h，i）腫瘤體積的定量（左圖）和轉(zhuǎn)移率（右圖）。（h）所有腫瘤。（i）腫瘤大小< 10 mm³。

6. miR-134-PDCD7-E-cad在人類(lèi)OSCC中的激活

圖6. miR-134-PDCD7-E-cad在人類(lèi)OPMD和OSCC組織中的狀態(tài)。（a，b）OPMD。 （c - g）OSCC。（a，c）miR-134染色和PDCD7和E-cad在OPMD和OSCC組織陣列中的免疫反應(yīng)性。上圖，病變表現(xiàn)出強(qiáng)miR-134染色和相對(duì)較低的PDCD7和ECAD免疫反應(yīng);下圖，病變表現(xiàn)出弱miR-134染色和相對(duì)較高的PDCD7和E-cad免疫反應(yīng)。OPMD，× 200; OSCC，× 100。（b）左圖，miR-134，PDCD7和E-cad定量分析。中圖，heatmap blot表明OPMD中miR-134，PDCD7和E-cad表達(dá)之間的相關(guān)性。右圖，PDCD7與E-cad表達(dá)的相關(guān)性分析。（d）OSCC組織陣列中miR-134，PDCD7和E-cad評(píng)分前后圖。（e）左圖和（f）heatmap blot分別說(shuō)明OSCC組織陣列中miR134/PDCD7/E-cad表達(dá)之間的相關(guān)性，以及miR134/PDCD7/E-CAD/WWOX在組織對(duì)中的表達(dá)。（e）右圖，組織陣列中PDCD7和E-cad表達(dá)之間的相關(guān)性分析。（g）總生存期（左圖）和無(wú)病生存期（右圖）。比較具有高miR-134表達(dá)水平和低PDCD7或E-cad表達(dá)水平的OSCC腫瘤，以及具有相反表達(dá)譜的腫瘤。OS，整生存期；DFS，無(wú)病生存期。

結(jié)論：

該研究闡明了在口腔癌中miR-134靶向PDCD7以驅(qū)動(dòng)致癌性，并且PDCD7反式激活E-鈣粘蛋白表達(dá)。在小鼠模型中，PDCD7的敲除增加了口腔癌異種移植物的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。 miR-134-PDCD7-E-cad調(diào)節(jié)軸的激活發(fā)生在口腔癌發(fā)生的早期階段。 這項(xiàng)工作顯示miR-134抑制和PDCD7誘導(dǎo)對(duì)口腔癌消除的潛力。

參考文獻(xiàn)：Shih-Yuan Peng , Hsi-Feng Tu, Cheng-Chieh Yang, Cheng-Hsien Wu,Chung-Ji Liu,Kuo-Wei Chang , Shu-Chun Lin. miR-134 targets PDCD7 to reduce E-cadherin expression and enhance oral cancer progression. International Journal of Cancer. 2018 Jul