表觀遺傳又取得顛覆性進展啦！PVT1啟動子可以作為獨立的腫瘤相關DNA元件

2018年5月3日，表觀遺傳大牛張元豪課題組再度在頂級科學期刊Cell上發(fā)表題為“Promoter of lncRNA Gene PVT1 Is a Tumor-Suppressor DNA Boundary Element”重磅研究，研究人員提出PVT1編碼致癌lncRNA，但人類癌癥中復發(fā)性易位和缺失可能是另一種機制。之前的研究表明PVT1編碼致癌lncRNA，但人類癌癥中復發(fā)性易位和缺失可能是另一種機制。在這里，研究人員顯示PVT1啟動子具有獨立于PVT1 lncRNA的腫瘤抑制功能。 PVT1啟動子的CRISPR干擾增強了乳腺癌細胞的競爭和細胞增殖。PVT1和MYC致癌基因的啟動子位于染色體8q24上55kb處，競爭性結合PVT1基因座中的四個基因內(nèi)增強子，從而允許PVT1啟動子調(diào)節(jié)暫停釋放MYC轉(zhuǎn)錄。PVT1經(jīng)歷發(fā)育調(diào)控的單等位基因表達，且PVT1啟動子僅通過啟動子競爭從相同染色體抑制MYC表達。癌癥的基因組測序鑒定包含人類PVT1啟動子的復發(fā)突變，并且基因組編輯證實PVT1啟動子突變促進癌細胞生長。綜上，lncRNA基因的調(diào)控序列（如本文的PVT1啟動子）可以作為潛在的疾病相關DNA元件。

技術路線

結果

圖1 CRISPRi干擾PVT1促進腫瘤細胞增殖與競爭

A. PVT1在基因組上的6個轉(zhuǎn)錄起始位點的位置；B. 基因組CRISPRi干擾TSS區(qū)，只有TSS1與TSS2區(qū)干擾后能促進細胞的增殖；C. 在MDA-MB-231細胞中的競爭實驗表明，干擾PVT1后細胞的競爭能力增強，且克隆形成表現(xiàn)出星狀的侵襲形態(tài)；D. In vivo的動物模型也表明CRISPRi干擾PVT1促進腫瘤細胞增殖。

圖2 CRISPRi干擾PVT1促進MYC的表達

A,B. CRISPRi干擾PVT1，通過RNA-seq檢測到MYC的RNA上調(diào)幅度最大,WB也驗證了MYC在蛋白水平上增長了2~3倍；C. 設計PVT1 TSS1的上下游sgRNA,發(fā)現(xiàn)下游的sgRNA才能逆轉(zhuǎn)PVT1與MYC的表達；D,E. siRNA介導的MYC mRNA的降解恢復了CRISPRi-PVT1的增殖優(yōu)勢F PVT1沉默細胞的細胞生長會增加MYC表達。

圖3 解耦PVT1啟動子與PVT1 lncRNA在MYC表達與增殖中的作用

A. 全長的PTV1的dCAS9干擾與dCAS9-KRAB干擾能相同的影響PTV1的表達，但并不能增加MYC的表達與增殖；B,C. 同樣的，ASO以及siRNA能在RNA水平上沉默PVT1，但并不能增加MYC的表達與增殖。

圖4 啟動子競爭是PVT1與MYC對抗的基礎

A,B. H3K27的HiChIPPVT1和MYC致癌基因的啟動子位于染色體8q24上55kb處，競爭性結合PVT1基因座中的四個基因內(nèi)增強子822E, 866E, 912E, and 919E,同時在MCF7細胞內(nèi)也印證了這一點；C. 這些增強子在MDA-MB-231細胞中的CRISPRi降低了MYC和PVT1 mRNA的水平，表明內(nèi)源性PVT1增強子調(diào)控了這兩個基因；D,E. ChIP-qPCR實驗表明CRISPRi-PVT1在PVT1啟動子上減少了BRD4的占用，但在MYC啟動子上顯著增加了BRD4的占有率,同樣的Pol II-S5P的占有率也呈現(xiàn)同樣的趨勢；F,G. CRISPRi-PVT1降低了PVT1的Pol II-S2P卻促進了MYC的轉(zhuǎn)錄暫停后的延伸，4sU標記的新生RNA的轉(zhuǎn)錄也呈現(xiàn)同樣的競爭趨勢。

圖5 PVT1啟動子可逆地調(diào)控MYC轉(zhuǎn)錄

A,B. 利用dCAS9-VP64增強PVT1的轉(zhuǎn)錄，發(fā)現(xiàn)MYC mRNA的表達水平下調(diào)；C~F. PVT1的CRISPRa 能減少MYC啟動子對BRD4的占有率以及減少 MYC Pol II 的延伸以及新生RNA的合成。

圖6 單等位基因的PVT1啟動子順式調(diào)控了MYC表達

A. 以等位基因特異性表達模式分離單克隆，分析染色體重排，組蛋白修飾與RNA轉(zhuǎn)錄；B. 在mESC向mNPC分化的過程中，PVT1呈現(xiàn)由雙等位基因轉(zhuǎn)錄到單等位基因轉(zhuǎn)錄的變化,并且單等位基因的PTV1啟動子的激活抑制了MYC的染色體重排；C. 單等位基因的PVT1啟動子順式調(diào)控了MYC表達在多種mNPC克?。?strong>D. 染色體重排的PTV1啟動子的d-score與MYC mRNA的d-score是呈現(xiàn)拮抗的趨勢，D,E也說明了這一點。

圖7 癌癥的基因組測序鑒定包含人類PVT1啟動子的復發(fā)突變

A. PVT1啟動子的DNA序列在TSS1與TSS2高度保守，此序列的波動會引起很嚴重的損傷；B,C. PVT1的啟動子區(qū)域相較于其他lncRNA的啟動子具有更明顯的結構變化（SVs),同時在乳腺癌里也具有此現(xiàn)象；D,E,F. 癌癥的基因組測序鑒定包含人類PVT1啟動子的復發(fā)突變,并且基因組編輯證實PVT1啟動子突變促進癌細胞生長。

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