表觀遺傳又取得顛覆性進(jìn)展啦!PVT1啟動子可以作為獨(dú)立的腫瘤相關(guān)DNA元件

欄目:最新研究動態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2018-07-27
2018年5月3日,表觀遺傳大牛張?jiān)勒n題組再度在頂級科學(xué)期刊Cell上發(fā)表題為“Promoter of lncRNA Gene PVT1 Is ......

2018年5月3日,表觀遺傳大牛張?jiān)勒n題組再度在頂級科學(xué)期刊Cell上發(fā)表題為“Promoter of lncRNA Gene PVT1 Is a Tumor-Suppressor DNA Boundary Element”重磅研究,研究人員提出PVT1編碼致癌lncRNA,但人類癌癥中復(fù)發(fā)性易位和缺失可能是另一種機(jī)制。之前的研究表明PVT1編碼致癌lncRNA,但人類癌癥中復(fù)發(fā)性易位和缺失可能是另一種機(jī)制。在這里,研究人員顯示PVT1啟動子具有獨(dú)立于PVT1 lncRNA的腫瘤抑制功能。 PVT1啟動子的CRISPR干擾增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞的競爭和細(xì)胞增殖。PVT1和MYC致癌基因的啟動子位于染色體8q24上55kb處,競爭性結(jié)合PVT1基因座中的四個(gè)基因內(nèi)增強(qiáng)子,從而允許PVT1啟動子調(diào)節(jié)暫停釋放MYC轉(zhuǎn)錄。PVT1經(jīng)歷發(fā)育調(diào)控的單等位基因表達(dá),且PVT1啟動子僅通過啟動子競爭從相同染色體抑制MYC表達(dá)。癌癥的基因組測序鑒定包含人類PVT1啟動子的復(fù)發(fā)突變,并且基因組編輯證實(shí)PVT1啟動子突變促進(jìn)癌細(xì)胞生長。綜上,lncRNA基因的調(diào)控序列(如本文的PVT1啟動子)可以作為潛在的疾病相關(guān)DNA元件。

技術(shù)路線

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結(jié)果

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圖1 CRISPRi干擾PVT1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖與競爭

A. PVT1在基因組上的6個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的位置;B. 基因組CRISPRi干擾TSS區(qū),只有TSS1與TSS2區(qū)干擾后能促進(jìn)細(xì)胞的增殖;C. 在MDA-MB-231細(xì)胞中的競爭實(shí)驗(yàn)表明,干擾PVT1后細(xì)胞的競爭能力增強(qiáng),且克隆形成表現(xiàn)出星狀的侵襲形態(tài);D. In vivo的動物模型也表明CRISPRi干擾PVT1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。


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圖2 CRISPRi干擾PVT1促進(jìn)MYC的表達(dá)

A,B. CRISPRi干擾PVT1,通過RNA-seq檢測到MYC的RNA上調(diào)幅度最大,WB也驗(yàn)證了MYC在蛋白水平上增長了2~3倍;C. 設(shè)計(jì)PVT1 TSS1的上下游sgRNA,發(fā)現(xiàn)下游的sgRNA才能逆轉(zhuǎn)PVT1與MYC的表達(dá);D,E. siRNA介導(dǎo)的MYC mRNA的降解恢復(fù)了CRISPRi-PVT1的增殖優(yōu)勢F PVT1沉默細(xì)胞的細(xì)胞生長會增加MYC表達(dá)。


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圖3 解耦PVT1啟動子與PVT1 lncRNA在MYC表達(dá)與增殖中的作用

A. 全長的PTV1的dCAS9干擾與dCAS9-KRAB干擾能相同的影響PTV1的表達(dá),但并不能增加MYC的表達(dá)與增殖;B,C. 同樣的,ASO以及siRNA能在RNA水平上沉默PVT1,但并不能增加MYC的表達(dá)與增殖。

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圖4 啟動子競爭是PVT1與MYC對抗的基礎(chǔ)

A,B. H3K27的HiChIPPVT1和MYC致癌基因的啟動子位于染色體8q24上55kb處,競爭性結(jié)合PVT1基因座中的四個(gè)基因內(nèi)增強(qiáng)子822E, 866E, 912E, and 919E,同時(shí)在MCF7細(xì)胞內(nèi)也印證了這一點(diǎn);C. 這些增強(qiáng)子在MDA-MB-231細(xì)胞中的CRISPRi降低了MYC和PVT1 mRNA的水平,表明內(nèi)源性PVT1增強(qiáng)子調(diào)控了這兩個(gè)基因;D,E. ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)表明CRISPRi-PVT1在PVT1啟動子上減少了BRD4的占用,但在MYC啟動子上顯著增加了BRD4的占有率,同樣的Pol II-S5P的占有率也呈現(xiàn)同樣的趨勢;F,G. CRISPRi-PVT1降低了PVT1的Pol II-S2P卻促進(jìn)了MYC的轉(zhuǎn)錄暫停后的延伸,4sU標(biāo)記的新生RNA的轉(zhuǎn)錄也呈現(xiàn)同樣的競爭趨勢。


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圖5 PVT1啟動子可逆地調(diào)控MYC轉(zhuǎn)錄

A,B. 利用dCAS9-VP64增強(qiáng)PVT1的轉(zhuǎn)錄,發(fā)現(xiàn)MYC mRNA的表達(dá)水平下調(diào);C~F. PVT1的CRISPRa 能減少M(fèi)YC啟動子對BRD4的占有率以及減少 MYC Pol II 的延伸以及新生RNA的合成。


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圖6 單等位基因的PVT1啟動子順式調(diào)控了MYC表達(dá)

A. 以等位基因特異性表達(dá)模式分離單克隆,分析染色體重排,組蛋白修飾與RNA轉(zhuǎn)錄;B. 在mESC向mNPC分化的過程中,PVT1呈現(xiàn)由雙等位基因轉(zhuǎn)錄到單等位基因轉(zhuǎn)錄的變化,并且單等位基因的PTV1啟動子的激活抑制了MYC的染色體重排;C. 單等位基因的PVT1啟動子順式調(diào)控了MYC表達(dá)在多種mNPC克??;D. 染色體重排的PTV1啟動子的d-score與MYC mRNA的d-score是呈現(xiàn)拮抗的趨勢,D,E也說明了這一點(diǎn)。


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圖7 癌癥的基因組測序鑒定包含人類PVT1啟動子的復(fù)發(fā)突變

A. PVT1啟動子的DNA序列在TSS1與TSS2高度保守,此序列的波動會引起很嚴(yán)重的損傷;B,C. PVT1的啟動子區(qū)域相較于其他lncRNA的啟動子具有更明顯的結(jié)構(gòu)變化(SVs),同時(shí)在乳腺癌里也具有此現(xiàn)象;D,E,F. 癌癥的基因組測序鑒定包含人類PVT1啟動子的復(fù)發(fā)突變,并且基因組編輯證實(shí)PVT1啟動子突變促進(jìn)癌細(xì)胞生長。


本文框架

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