表觀遺傳又取得顛覆性進(jìn)展啦！PVT1啟動(dòng)子可以作為獨(dú)立的腫瘤相關(guān)DNA元件

2018年5月3日，表觀遺傳大牛張?jiān)勒n題組再度在頂級(jí)科學(xué)期刊Cell上發(fā)表題為“Promoter of lncRNA Gene PVT1 Is a Tumor-Suppressor DNA Boundary Element”重磅研究，研究人員提出PVT1編碼致癌lncRNA，但人類癌癥中復(fù)發(fā)性易位和缺失可能是另一種機(jī)制。之前的研究表明PVT1編碼致癌lncRNA，但人類癌癥中復(fù)發(fā)性易位和缺失可能是另一種機(jī)制。在這里，研究人員顯示PVT1啟動(dòng)子具有獨(dú)立于PVT1 lncRNA的腫瘤抑制功能。 PVT1啟動(dòng)子的CRISPR干擾增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞的競(jìng)爭(zhēng)和細(xì)胞增殖。PVT1和MYC致癌基因的啟動(dòng)子位于染色體8q24上55kb處，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合PVT1基因座中的四個(gè)基因內(nèi)增強(qiáng)子，從而允許PVT1啟動(dòng)子調(diào)節(jié)暫停釋放MYC轉(zhuǎn)錄。PVT1經(jīng)歷發(fā)育調(diào)控的單等位基因表達(dá)，且PVT1啟動(dòng)子僅通過(guò)啟動(dòng)子競(jìng)爭(zhēng)從相同染色體抑制MYC表達(dá)。癌癥的基因組測(cè)序鑒定包含人類PVT1啟動(dòng)子的復(fù)發(fā)突變，并且基因組編輯證實(shí)PVT1啟動(dòng)子突變促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)。綜上，lncRNA基因的調(diào)控序列（如本文的PVT1啟動(dòng)子）可以作為潛在的疾病相關(guān)DNA元件。

技術(shù)路線

結(jié)果

圖1 CRISPRi干擾PVT1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖與競(jìng)爭(zhēng)

A. PVT1在基因組上的6個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的位置；B. 基因組CRISPRi干擾TSS區(qū)，只有TSS1與TSS2區(qū)干擾后能促進(jìn)細(xì)胞的增殖；C. 在MDA-MB-231細(xì)胞中的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)表明，干擾PVT1后細(xì)胞的競(jìng)爭(zhēng)能力增強(qiáng)，且克隆形成表現(xiàn)出星狀的侵襲形態(tài)；D. In vivo的動(dòng)物模型也表明CRISPRi干擾PVT1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。

圖2 CRISPRi干擾PVT1促進(jìn)MYC的表達(dá)

A,B. CRISPRi干擾PVT1，通過(guò)RNA-seq檢測(cè)到MYC的RNA上調(diào)幅度最大,WB也驗(yàn)證了MYC在蛋白水平上增長(zhǎng)了2~3倍；C. 設(shè)計(jì)PVT1 TSS1的上下游sgRNA,發(fā)現(xiàn)下游的sgRNA才能逆轉(zhuǎn)PVT1與MYC的表達(dá)；D,E. siRNA介導(dǎo)的MYC mRNA的降解恢復(fù)了CRISPRi-PVT1的增殖優(yōu)勢(shì)F PVT1沉默細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)會(huì)增加MYC表達(dá)。

圖3 解耦PVT1啟動(dòng)子與PVT1 lncRNA在MYC表達(dá)與增殖中的作用

A. 全長(zhǎng)的PTV1的dCAS9干擾與dCAS9-KRAB干擾能相同的影響PTV1的表達(dá)，但并不能增加MYC的表達(dá)與增殖；B,C. 同樣的，ASO以及siRNA能在RNA水平上沉默PVT1，但并不能增加MYC的表達(dá)與增殖。

圖4 啟動(dòng)子競(jìng)爭(zhēng)是PVT1與MYC對(duì)抗的基礎(chǔ)

A,B. H3K27的HiChIPPVT1和MYC致癌基因的啟動(dòng)子位于染色體8q24上55kb處，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合PVT1基因座中的四個(gè)基因內(nèi)增強(qiáng)子822E, 866E, 912E, and 919E,同時(shí)在MCF7細(xì)胞內(nèi)也印證了這一點(diǎn)；C. 這些增強(qiáng)子在MDA-MB-231細(xì)胞中的CRISPRi降低了MYC和PVT1 mRNA的水平，表明內(nèi)源性PVT1增強(qiáng)子調(diào)控了這兩個(gè)基因；D,E. ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)表明CRISPRi-PVT1在PVT1啟動(dòng)子上減少了BRD4的占用，但在MYC啟動(dòng)子上顯著增加了BRD4的占有率,同樣的Pol II-S5P的占有率也呈現(xiàn)同樣的趨勢(shì)；F,G. CRISPRi-PVT1降低了PVT1的Pol II-S2P卻促進(jìn)了MYC的轉(zhuǎn)錄暫停后的延伸，4sU標(biāo)記的新生RNA的轉(zhuǎn)錄也呈現(xiàn)同樣的競(jìng)爭(zhēng)趨勢(shì)。

圖5 PVT1啟動(dòng)子可逆地調(diào)控MYC轉(zhuǎn)錄

A,B. 利用dCAS9-VP64增強(qiáng)PVT1的轉(zhuǎn)錄，發(fā)現(xiàn)MYC mRNA的表達(dá)水平下調(diào)；C~F. PVT1的CRISPRa 能減少M(fèi)YC啟動(dòng)子對(duì)BRD4的占有率以及減少 MYC Pol II 的延伸以及新生RNA的合成。

圖6 單等位基因的PVT1啟動(dòng)子順式調(diào)控了MYC表達(dá)

A. 以等位基因特異性表達(dá)模式分離單克隆，分析染色體重排，組蛋白修飾與RNA轉(zhuǎn)錄；B. 在mESC向mNPC分化的過(guò)程中，PVT1呈現(xiàn)由雙等位基因轉(zhuǎn)錄到單等位基因轉(zhuǎn)錄的變化,并且單等位基因的PTV1啟動(dòng)子的激活抑制了MYC的染色體重排；C. 單等位基因的PVT1啟動(dòng)子順式調(diào)控了MYC表達(dá)在多種mNPC克隆；D. 染色體重排的PTV1啟動(dòng)子的d-score與MYC mRNA的d-score是呈現(xiàn)拮抗的趨勢(shì)，D,E也說(shuō)明了這一點(diǎn)。

圖7 癌癥的基因組測(cè)序鑒定包含人類PVT1啟動(dòng)子的復(fù)發(fā)突變

A. PVT1啟動(dòng)子的DNA序列在TSS1與TSS2高度保守，此序列的波動(dòng)會(huì)引起很嚴(yán)重的損傷；B,C. PVT1的啟動(dòng)子區(qū)域相較于其他lncRNA的啟動(dòng)子具有更明顯的結(jié)構(gòu)變化（SVs),同時(shí)在乳腺癌里也具有此現(xiàn)象；D,E,F. 癌癥的基因組測(cè)序鑒定包含人類PVT1啟動(dòng)子的復(fù)發(fā)突變,并且基因組編輯證實(shí)PVT1啟動(dòng)子突變促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

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