microRNAs在內(nèi)皮細胞中介導衰老相關(guān)的NRT2下調(diào)

氧化應(yīng)激易導致多種衰老相關(guān)疾病的發(fā)生，如心血管疾病和癌癥等。在衰老過程中，活性氧產(chǎn)生的增加通常伴隨著氧化應(yīng)激的適應(yīng)性應(yīng)激反應(yīng)的下降。這種下降主要是由于抗氧化劑生產(chǎn)的減少。核因子E2相關(guān)因子2（NRF2）是調(diào)節(jié)氧化和親電應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，同時它也被證實在細胞代謝調(diào)控中發(fā)揮作用。NRF2在衰老過程中表達會下降，但機制尚不清楚。2018年6月22號Redox Biology（IF=7.126）雜志上發(fā)表了題為“MicroRNAs mediate the senescence-associated decline of NRF2 in endothelial cells”的論文，在這項研究中發(fā)現(xiàn)，在老內(nèi)皮細胞豐富的microRNA（miRNA）通過直接靶向NRF2 mRNA從而降低NRF2表達。這種現(xiàn)象在miRNA抑制劑作用下會逆轉(zhuǎn)。與衰老相關(guān)的NRF2下調(diào)會降低內(nèi)皮糖酵解活性和應(yīng)激耐受性，兩者在恢復NRF2表達后也會恢復。操縱與衰老相關(guān)miRNA水平與NRF2結(jié)果一致也會影響糖酵解活性和應(yīng)激耐受性。本研究結(jié)論是衰老相關(guān)miRNA會使NRF2的表達下降，從而有助于抑制細胞衰老過程中的適應(yīng)性反應(yīng)。

技術(shù)路線

結(jié)果

1. NRF2在衰老的內(nèi)皮細胞中表達下降。

圖1. NRF2在衰老的內(nèi)皮細胞中的表達下降

A. qPCR 檢測NRF2 表達基因、核因子、Erythroid 2 Like 2 (NFE2L2) (n=3)以及NRF2在年輕(p4)和衰老(p16) HUVECs中的WB檢測。B. NRF2靶基因HMOX1在年輕 (p4) 和衰老 (p16) HUVECs中的表達。C. NFE2L2 和HMOX1 的mRNA (n=6) in oxPAPC處理后的細胞(30 μg/ml, 10 h)中的表達. 差異倍數(shù)是根據(jù)各自的對照值計算的。(所有數(shù)據(jù)：平均值 ± SD, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).

2.在衰老內(nèi)皮細胞中增加NRF2表達可恢復糖酵解過程。

圖2. NRF2過表達恢復糖酵解活性和耐受性

A-B. 糖酵解壓力測試在年輕 (p4, p8)和衰老的(p12, p16) HUVECs中 (A) and NRF2過表達HUVECs中(B). 數(shù)據(jù)用細胞外酸化率(ECAR)表示，歸一化為蛋白濃度。糖酵解速率是細胞在加入飽和葡萄糖后所達到的ECAR速率。糖酵解能力是加入寡聚霉素后細胞群達到的最大ECAR速率，它能抑制氧化磷酸化。值得注意的是，（B）的結(jié)果來自于單獨運行，因此不能將樣品之間的值進行比較。(所有的數(shù)據(jù):平均值 ± SEM, n=5, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).

3.增加NRF2表達不能恢復衰老內(nèi)皮細胞的增殖。

圖3. 過表達NRF2和信號通路激活沒有恢復增殖能力

年輕(p4) 和衰老(p16) 的(A), 衰老(p16) NRF2過表達的 (B)，和衰老(p16) oxPAPC處理過(C)的 HUVECs中細胞增殖和基因表達。A. 增殖和qPCR的差異倍數(shù)是根據(jù)年輕細胞的值計算的 (增殖：n=18 ，qPCR ：n=9)。B. 增殖和qPCR的差異倍數(shù)是根據(jù)對照組年輕和衰老細胞的值計算的(增殖：n=48，qPCR ：n=6). C. 增殖和qPCR的差異倍數(shù)是根據(jù)oxPAPC對照組年輕和衰老細胞的值計算的 (增殖：n=36，qPCR ：n=3)。(所有的數(shù)據(jù)：平均值±SD, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).

4.在衰老的內(nèi)皮細胞中存在著豐富的microRNAs，衰老相關(guān)的microRNAs靶向 NRF2。

圖4. miRNAs有助于衰老相關(guān)的NRF2下降

A. 在正常HUVECs（n＝4）中miR21、miR100和mi-126的標準化microRNA測序數(shù)據(jù)（每百萬個標簽，TPM）?！癟op 50”顯示了數(shù)據(jù)中50個最豐富的miRNA的平均值。B. 用生物素化miRNA進行miRNA-126、miR21、mi-100和CEL-miR-39（對照miRNA，ctrl）的Pull-down 測定。NRF2的富集是根據(jù)對照（CEL-miR-39）值的差異倍數(shù)（n＝8）計算的。C. 在HUVECs中轉(zhuǎn)染miRNA-126、miR21、miR-100和miR-34類似物進行NRF2進行WB實驗，用于miRNA的過表達和miRNA抑制劑。對照（CTRL）指miRN類似物和抑制劑（P6，n＝3）各自的對照。D. NFR2在miRNA沉默的衰老（p16）HUVEC中的表達（qPCR：n＝9；Western blot：n＝3）。根據(jù)各自的對照組計算差異倍數(shù)。顯示一個代表性的WB實驗。E. miRNA過度表達年輕（P4）HUVECs中糖酵解應(yīng)力測試（n＝10）。計算數(shù)據(jù)為胞外酸化速率（ECAR）歸一化蛋白濃度，并根據(jù)類似物對照值計算差異倍數(shù)。F. NFR2靶基因NQO1在基礎(chǔ)條件下抑制miRNA和oxPAPC處理過miRNA過表達的衰老（P12）HUVECs中的表達。抑制劑的結(jié)果是根據(jù)抑制劑的對照計算的，類似物的值是根據(jù)基礎(chǔ)條件下類似物對照計算的。線表示在基礎(chǔ)條件下抑制劑/類似物對照的表達。（所有條形圖：平均值±SD，*p＜0.05，*p＜0.01，*** p＜0.001）。

參考文獻：Kuosmanen, S. M., Sihvola, V., Kansanen, E., Kaikkonen, M. U., & Levonen, A. L. (2018). MicroRNAs mediate the senescence-associated decline of NRF2 in endothelial cells. Redox Biology.