雄激素受體陰性誘導(dǎo)長(zhǎng)鏈非編碼RNA ARNILA與miR-204結(jié)合促進(jìn)三陰性乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移

雄激素受體（AR）正在成為三陰性乳腺癌（TNBC）中一種新的預(yù)后生物標(biāo)志物，但潛在的機(jī)制尚不清楚。近日發(fā)表在《Cell Death & Differentiation》(IF=8.0)的文章《An androgen receptor negatively induced long non-coding RNA ARNILA binding to miR-204 promotes the invasion and metastasis of triple-negative breast cancer》探究了這一機(jī)制。由于越來(lái)越多的證據(jù)表明長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）調(diào)節(jié)重要的癌癥標(biāo)志物，故假設(shè)AR調(diào)節(jié)的lncRNA可能在TNBC進(jìn)展中發(fā)揮作用。在三種TNBC細(xì)胞系（MDA-MB-231、Hs578T和MDA-MB-436）中進(jìn)行了雙氫睪酮（DHT）處理或不處理的實(shí)驗(yàn)，鑒定了AR陰性誘導(dǎo)的lncRNA（ARNILA），其與TNBC患者的無(wú)進(jìn)展生存期（poor progression-free survival PFS）相關(guān)并促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、體內(nèi)外侵襲和轉(zhuǎn)移。隨后，證明了ARNILA作為miR-204的競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA（ceRNA）起促進(jìn)其靶基因Sox4的表達(dá)的作用，已知該靶基因可誘導(dǎo)EMT并促進(jìn)乳腺癌發(fā)展，從而促進(jìn)TNBC的ENT、侵襲和轉(zhuǎn)移。這項(xiàng)研究結(jié)果不僅為lncRNA調(diào)節(jié)AR的機(jī)制提供了新的見(jiàn)解，而且還提出ARNILA作為抑制TNBC患者轉(zhuǎn)移的替代治療靶點(diǎn)。

技術(shù)路線(xiàn)

結(jié)果

1. AR的陽(yáng)性表達(dá)與TNBC較好的預(yù)后相關(guān)。

圖1 TNBC中的AR表達(dá)和與存活的關(guān)系

a 88例TNBC患者AR表達(dá)水平與PFS（logrank檢驗(yàn)）的相關(guān)性。b 來(lái)自Kaplan.Meier Plotter（http：//www.kmplot.com / analysis /）的基底樣乳腺癌中RFS與AR表達(dá)水平之間的相關(guān)性（logrank測(cè)試）。c AR陽(yáng)性組與AR陰性組PFS風(fēng)險(xiǎn)比的森林圖。d 來(lái)自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的AR mRNA水平，包括14個(gè)TNBC腫瘤和與其成對(duì)的正常組織。

2. AR陰性誘導(dǎo)的lncRNA（ARNILA）的鑒定。

圖2 ARNILA的鑒定

a 用或不用DHT處理的MDA-MB-231，Hs578T和MDA-MB-436細(xì)胞的lncRNA微陣列數(shù)據(jù)的熱圖展示（差異倍數(shù)≥2.0，P <0.05）。b 通過(guò)用或不用DHT處理的MDA-MB-231，Hs578T和MDA-MB-436細(xì)胞的qRT-PCR測(cè)定ARNILA的表達(dá)。c FISH圖像顯示ARNILA在MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞的定位。d 上：TNBC患者的石蠟包埋組織中ARNILA和AR的典型FISH圖像。下：88例TNBC患者中ARNILA和AR表達(dá)的關(guān)系。e 88例TNBC患者中ARNILA表達(dá)水平與PFS的相關(guān)性（對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)）。f 上：ANRILA啟動(dòng)子內(nèi)的引物對(duì)位置。下：在MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞中ARNILA啟動(dòng)子上AR豐度的ChIP測(cè)定。陽(yáng)性和陰性對(duì)照分別表示為input和IgG。結(jié)果表示為平均值±SD。* P <0.05，** P <0.01。

3. ARNILA作為miR-204的ceRNA起到促進(jìn)Sox4表達(dá)的作用。

圖3 ARNILA通過(guò)結(jié)合miR-204上調(diào)Sox4

a 根據(jù)miRanda軟件預(yù)測(cè)的最大分?jǐn)?shù)得出的結(jié)合ARNILA的前十個(gè)預(yù)測(cè)的miRNA。根據(jù)Kaplan-Meier法推測(cè)的未治療TNBC患者中miRNA表達(dá)和OS之間的關(guān)系（對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)）。b 根據(jù)Kaplan-Meier法推測(cè)的TNBC患者AR表達(dá)水平與OS之間的關(guān)系（對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)）。根據(jù)自動(dòng)選擇最佳截止值將患者分為低和高AR表達(dá)。c 左：miRanda軟件推測(cè)的ARNILA 3'UTR中的miR-204 MRE。種子序列以粗體表示，突變體序列以紅色表示。右：轉(zhuǎn)染特定的miRNA類(lèi)似物后293T細(xì)胞中ARNILA-Wt和ARNILA-Mut的熒光素酶活性。數(shù)據(jù)表示為海腎熒光素酶活性與螢火蟲(chóng)熒光素酶活性之比。d 左：由TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)推測(cè)的Sox4的3'UTR中的miR-204 MRE。種子序列以粗體表示，突變體序列以紅色表示。右：轉(zhuǎn)染特定的miRNA類(lèi)似物后293T細(xì)胞中Sox4-Wt和Sox4-Mut的熒光素酶活性。數(shù)據(jù)表示為海腎熒光素酶活性與螢火蟲(chóng)熒光素酶活性之比。e，f 左：miR-204類(lèi)似物（e）或抑制劑（f）轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞中Sox4表達(dá)的WB分析。右：左圖中顯示的蛋白質(zhì)水平的量化。g 上：特定質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞中Sox4表達(dá)的WB分析。下：上圖中顯示的蛋白質(zhì)水平的定量。h 上：特定質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Hs578T細(xì)胞中Sox4表達(dá)的WB分析。下：上圖中顯示的蛋白質(zhì)水平的定量。結(jié)果表示為平均值±SD。* P <0.05。NS表示無(wú)顯著性差異。

4. Sox4與AR呈負(fù)相關(guān)，并預(yù)測(cè)TNBC的臨床結(jié)果不佳。

圖4 Sox4與AR和高生存率呈負(fù)相關(guān)

a 左：特定處理后MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞中AR和Sox4表達(dá)的WB分析。中間和右側(cè)：左圖中顯示的蛋白質(zhì)水平的量化。結(jié)果表示為平均值±SD。* P <0.05。b 151例TNBC患者TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中AR和Sox4的表達(dá)。c 根據(jù)Kaplan-Meier法推測(cè)的TNBC患者Sox4表達(dá)水平與RFS之間的關(guān)系（對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)）。d 上：TNBC患者石蠟包埋組織中AR和Sox4的典型IHC圖像。下：88例TNBC患者中AR和Sox4表達(dá)的相關(guān)性。e 88例TNBC患者的Sox4水平與PFS之間的關(guān)系（對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)）。f 88例TNBC患者AR-Sox4結(jié)合水平與PFS的關(guān)系（對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)）。

5. ARNILA在體外促進(jìn)遷移，侵襲和EMT。

圖5 ARNILA促進(jìn)體外遷移，侵襲和EMT

a 上：特定的轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞的創(chuàng)傷修復(fù)檢測(cè)。下：上圖中細(xì)胞傷口愈合的量化。b 上：特定的轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞的穿膜實(shí)驗(yàn)。下：膜下方遷移細(xì)胞的定量。c 左：特定處理后，MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞中E-鈣粘蛋白和N-鈣粘蛋白表達(dá)的WB分析。中間和右側(cè)：左圖中顯示的蛋白質(zhì)水平的量化。結(jié)果表示為平均值±SD。* P <0.05。

6. Sox4負(fù)責(zé)ARNILA介導(dǎo)的體外遷移，侵襲和EMT。

圖6 Sox4負(fù)責(zé)ARNILA介導(dǎo)的體外遷移，侵襲和EMT

a 左：特定的轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞的創(chuàng)傷修復(fù)檢測(cè)。右：左圖中細(xì)胞傷口愈合的量化。b 下：特定轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞的穿膜實(shí)驗(yàn)。上：下圖中細(xì)胞遷移的量化。c 左：特定處理后，MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞中E-鈣粘蛋白和N-鈣粘蛋白表達(dá)的WB分析。右：左圖中顯示的蛋白質(zhì)水平的量化。結(jié)果表示為平均值±SD。* P <0.05。NS表示無(wú)顯著性差異。

7. ARNILA促進(jìn)體內(nèi)乳腺癌轉(zhuǎn)移。

圖7 ARNILA促進(jìn)體內(nèi)轉(zhuǎn)移

a 注射18F-FDG 1小時(shí)后小鼠的典型PET/CT圖像。肺和肝轉(zhuǎn)移用白色箭頭表示。b 兩組肺和肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生率（Fisher's exact t檢驗(yàn)）。c 分離的肺部明視野成像（上圖）和蘇木精和伊紅染色（中部和下部）的肺和肝臟中轉(zhuǎn)移性囊腫的典型圖像。用黑色箭頭表示肺和肝轉(zhuǎn)移。d TNBC中基于ARNILA的信號(hào)傳輸路線(xiàn)示意圖。在AR-positive TNBC（左）中，AR通過(guò)作為轉(zhuǎn)錄抑制因子顯著抑制ARNILA；因此，ARNILA的海綿狀功能由于其低表達(dá)水平而在這里很弱，并且miR-204被釋放以抑制Sox4。在AR-negative TNBC（右）中，由于AR的抑制減少，miR-204主要由ARNILA消耗，因此Sox4以高水平表達(dá)。