雄激素受體陰性誘導(dǎo)長鏈非編碼RNA ARNILA與miR-204結(jié)合促進(jìn)三陰性乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移

雄激素受體（AR）正在成為三陰性乳腺癌（TNBC）中一種新的預(yù)后生物標(biāo)志物，但潛在的機制尚不清楚。近日發(fā)表在《Cell Death & Differentiation》(IF=8.0)的文章《An androgen receptor negatively induced long non-coding RNA ARNILA binding to miR-204 promotes the invasion and metastasis of triple-negative breast cancer》探究了這一機制。由于越來越多的證據(jù)表明長鏈非編碼RNA（lncRNA）調(diào)節(jié)重要的癌癥標(biāo)志物，故假設(shè)AR調(diào)節(jié)的lncRNA可能在TNBC進(jìn)展中發(fā)揮作用。在三種TNBC細(xì)胞系（MDA-MB-231、Hs578T和MDA-MB-436）中進(jìn)行了雙氫睪酮（DHT）處理或不處理的實驗，鑒定了AR陰性誘導(dǎo)的lncRNA（ARNILA），其與TNBC患者的無進(jìn)展生存期（poor progression-free survival PFS）相關(guān)并促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、體內(nèi)外侵襲和轉(zhuǎn)移。隨后，證明了ARNILA作為miR-204的競爭性內(nèi)源RNA（ceRNA）起促進(jìn)其靶基因Sox4的表達(dá)的作用，已知該靶基因可誘導(dǎo)EMT并促進(jìn)乳腺癌發(fā)展，從而促進(jìn)TNBC的ENT、侵襲和轉(zhuǎn)移。這項研究結(jié)果不僅為lncRNA調(diào)節(jié)AR的機制提供了新的見解，而且還提出ARNILA作為抑制TNBC患者轉(zhuǎn)移的替代治療靶點。

技術(shù)路線

結(jié)果

1. AR的陽性表達(dá)與TNBC較好的預(yù)后相關(guān)。

圖1 TNBC中的AR表達(dá)和與存活的關(guān)系

a 88例TNBC患者AR表達(dá)水平與PFS（logrank檢驗）的相關(guān)性。b 來自Kaplan.Meier Plotter（http：//www.kmplot.com / analysis /）的基底樣乳腺癌中RFS與AR表達(dá)水平之間的相關(guān)性（logrank測試）。c AR陽性組與AR陰性組PFS風(fēng)險比的森林圖。d 來自TCGA數(shù)據(jù)庫的AR mRNA水平，包括14個TNBC腫瘤和與其成對的正常組織。

2. AR陰性誘導(dǎo)的lncRNA（ARNILA）的鑒定。

圖2 ARNILA的鑒定

a 用或不用DHT處理的MDA-MB-231，Hs578T和MDA-MB-436細(xì)胞的lncRNA微陣列數(shù)據(jù)的熱圖展示（差異倍數(shù)≥2.0，P <0.05）。b 通過用或不用DHT處理的MDA-MB-231，Hs578T和MDA-MB-436細(xì)胞的qRT-PCR測定ARNILA的表達(dá)。c FISH圖像顯示ARNILA在MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞的定位。d 上：TNBC患者的石蠟包埋組織中ARNILA和AR的典型FISH圖像。下：88例TNBC患者中ARNILA和AR表達(dá)的關(guān)系。e 88例TNBC患者中ARNILA表達(dá)水平與PFS的相關(guān)性（對數(shù)秩檢驗）。f 上：ANRILA啟動子內(nèi)的引物對位置。下：在MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞中ARNILA啟動子上AR豐度的ChIP測定。陽性和陰性對照分別表示為input和IgG。結(jié)果表示為平均值±SD。* P <0.05，** P <0.01。

3. ARNILA作為miR-204的ceRNA起到促進(jìn)Sox4表達(dá)的作用。

圖3 ARNILA通過結(jié)合miR-204上調(diào)Sox4

a 根據(jù)miRanda軟件預(yù)測的最大分?jǐn)?shù)得出的結(jié)合ARNILA的前十個預(yù)測的miRNA。根據(jù)Kaplan-Meier法推測的未治療TNBC患者中miRNA表達(dá)和OS之間的關(guān)系（對數(shù)秩檢驗）。b 根據(jù)Kaplan-Meier法推測的TNBC患者AR表達(dá)水平與OS之間的關(guān)系（對數(shù)秩檢驗）。根據(jù)自動選擇最佳截止值將患者分為低和高AR表達(dá)。c 左：miRanda軟件推測的ARNILA 3'UTR中的miR-204 MRE。種子序列以粗體表示，突變體序列以紅色表示。右：轉(zhuǎn)染特定的miRNA類似物后293T細(xì)胞中ARNILA-Wt和ARNILA-Mut的熒光素酶活性。數(shù)據(jù)表示為海腎熒光素酶活性與螢火蟲熒光素酶活性之比。d 左：由TargetScan數(shù)據(jù)庫推測的Sox4的3'UTR中的miR-204 MRE。種子序列以粗體表示，突變體序列以紅色表示。右：轉(zhuǎn)染特定的miRNA類似物后293T細(xì)胞中Sox4-Wt和Sox4-Mut的熒光素酶活性。數(shù)據(jù)表示為海腎熒光素酶活性與螢火蟲熒光素酶活性之比。e，f 左：miR-204類似物（e）或抑制劑（f）轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞中Sox4表達(dá)的WB分析。右：左圖中顯示的蛋白質(zhì)水平的量化。g 上：特定質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞中Sox4表達(dá)的WB分析。下：上圖中顯示的蛋白質(zhì)水平的定量。h 上：特定質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Hs578T細(xì)胞中Sox4表達(dá)的WB分析。下：上圖中顯示的蛋白質(zhì)水平的定量。結(jié)果表示為平均值±SD。* P <0.05。NS表示無顯著性差異。

4. Sox4與AR呈負(fù)相關(guān)，并預(yù)測TNBC的臨床結(jié)果不佳。

圖4 Sox4與AR和高生存率呈負(fù)相關(guān)

a 左：特定處理后MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞中AR和Sox4表達(dá)的WB分析。中間和右側(cè)：左圖中顯示的蛋白質(zhì)水平的量化。結(jié)果表示為平均值±SD。* P <0.05。b 151例TNBC患者TCGA數(shù)據(jù)庫中AR和Sox4的表達(dá)。c 根據(jù)Kaplan-Meier法推測的TNBC患者Sox4表達(dá)水平與RFS之間的關(guān)系（對數(shù)秩檢驗）。d 上：TNBC患者石蠟包埋組織中AR和Sox4的典型IHC圖像。下：88例TNBC患者中AR和Sox4表達(dá)的相關(guān)性。e 88例TNBC患者的Sox4水平與PFS之間的關(guān)系（對數(shù)秩檢驗）。f 88例TNBC患者AR-Sox4結(jié)合水平與PFS的關(guān)系（對數(shù)秩檢驗）。

5. ARNILA在體外促進(jìn)遷移，侵襲和EMT。

圖5 ARNILA促進(jìn)體外遷移，侵襲和EMT

a 上：特定的轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞的創(chuàng)傷修復(fù)檢測。下：上圖中細(xì)胞傷口愈合的量化。b 上：特定的轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞的穿膜實驗。下：膜下方遷移細(xì)胞的定量。c 左：特定處理后，MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞中E-鈣粘蛋白和N-鈣粘蛋白表達(dá)的WB分析。中間和右側(cè)：左圖中顯示的蛋白質(zhì)水平的量化。結(jié)果表示為平均值±SD。* P <0.05。

6. Sox4負(fù)責(zé)ARNILA介導(dǎo)的體外遷移，侵襲和EMT。

圖6 Sox4負(fù)責(zé)ARNILA介導(dǎo)的體外遷移，侵襲和EMT

a 左：特定的轉(zhuǎn)染后MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞的創(chuàng)傷修復(fù)檢測。右：左圖中細(xì)胞傷口愈合的量化。b 下：特定轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞的穿膜實驗。上：下圖中細(xì)胞遷移的量化。c 左：特定處理后，MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞中E-鈣粘蛋白和N-鈣粘蛋白表達(dá)的WB分析。右：左圖中顯示的蛋白質(zhì)水平的量化。結(jié)果表示為平均值±SD。* P <0.05。NS表示無顯著性差異。

7. ARNILA促進(jìn)體內(nèi)乳腺癌轉(zhuǎn)移。

圖7 ARNILA促進(jìn)體內(nèi)轉(zhuǎn)移

a 注射18F-FDG 1小時后小鼠的典型PET/CT圖像。肺和肝轉(zhuǎn)移用白色箭頭表示。b 兩組肺和肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生率（Fisher's exact t檢驗）。c 分離的肺部明視野成像（上圖）和蘇木精和伊紅染色（中部和下部）的肺和肝臟中轉(zhuǎn)移性囊腫的典型圖像。用黑色箭頭表示肺和肝轉(zhuǎn)移。d TNBC中基于ARNILA的信號傳輸路線示意圖。在AR-positive TNBC（左）中，AR通過作為轉(zhuǎn)錄抑制因子顯著抑制ARNILA；因此，ARNILA的海綿狀功能由于其低表達(dá)水平而在這里很弱，并且miR-204被釋放以抑制Sox4。在AR-negative TNBC（右）中，由于AR的抑制減少，miR-204主要由ARNILA消耗，因此Sox4以高水平表達(dá)。