Cicr-DNMT1能夠通過激活自噬促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展　

CircRNAs是一類廣泛表達(dá)在哺乳動物細(xì)胞中的非編碼RNA。全基因組分析揭示了環(huán)狀RNA的跨物種分布，并且其特性是進(jìn)化性保守的，這便進(jìn)一步揭示了環(huán)狀 RNA的特定的生理角色與功能。鑒于此，加拿大多倫多大學(xué)楊柏華教授帶領(lǐng)他的團(tuán)隊(duì)探究了circ-Dnmt1對乳腺癌的作用，并于2018年7月4日在Oncogene雜志（IF=7.5）發(fā)表了他們的研究成果，環(huán)形RNA circ-Dnmt1 通過調(diào)控p53和AUF1入核，促進(jìn)細(xì)胞自噬作用。Circ-Dnmt1是DNMT1基因第6和7外顯子反向拼接形成的，作者是通過芯片分析發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞中普遍存在circ-Dnmt1高表達(dá)的現(xiàn)象，因此針對該分子的作用機(jī)制展開了研究。過表達(dá)circ-Dnmt1能促進(jìn)細(xì)胞增殖，并且能增加對應(yīng)的Dnmt1的成熟的mRNA水平，但對該基因的轉(zhuǎn)錄出產(chǎn)物pre-mRNA沒有影響。過表達(dá)circ-Dnmt1能促進(jìn)細(xì)胞自噬，免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明p53和AUF1在circ-Dnmt1過表達(dá)后核定位增加了，RIP實(shí)驗(yàn)證明了circ-Dnmt1可以與p53和AUF1相互作用。核定位的p53促進(jìn)自噬相關(guān)基因的表達(dá)，而核定位的AUF1不能繼續(xù)調(diào)控Dnmt1的mRNA降解作用，導(dǎo)致該mRNA富集并促進(jìn)DNMT1蛋白的表達(dá)。小鼠皮下腫瘤模型實(shí)驗(yàn)表明過表達(dá)circ-Dnmt1顯著增加腫瘤的體積。

技術(shù)路線

結(jié)果
1. circ-Dnmt1在乳腺癌中高表達(dá)　　

圖1. 乳腺癌細(xì)胞中存在circ-Dnmt1過表達(dá)。

（a-c）通過芯片篩選，比較乳腺癌細(xì)胞與非癌乳腺細(xì)胞中circRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)了circ-Dnmt1在所有乳腺癌細(xì)胞中均有高表達(dá)。d. circ-Dnmt1在基因組的位置及過表達(dá)載體的構(gòu)建構(gòu)建。e. 驗(yàn)證了相關(guān)引物的特異性。f. Northern實(shí)驗(yàn)證明了circ-Dnmt1在細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源表達(dá)。g. circ-Dnmt1對MCF-7細(xì)胞增殖的影響。

2. circ-Dnmt1促進(jìn)細(xì)胞自噬

圖2. MCF-7細(xì)胞中過表達(dá)circ-Dnmt1可促進(jìn)細(xì)胞增殖。

（ab）. 過表達(dá)circ-Dnmt1后細(xì)胞衰老的比例明顯下降（β-gal染色陽性率低），LC3B明顯增多。c. 幾種自噬抑制劑處理后circ-Dnmt1表達(dá)會增加，這些抑制劑包括：SP600125、Chloroquine、LY294002、Wartmannin。d. 這些抑制劑的處理可阻止過表達(dá)circ-Dnmt1導(dǎo)致的細(xì)胞增殖和衰老相關(guān)的表型。（e-g）過表達(dá)circ-Dnmt1后，母基因Dnmt1的mRNA水平增加，但該基因轉(zhuǎn)錄初產(chǎn)物pre-mRNA（基于內(nèi)含子序列的引物）并沒有增加，說明不是通過促進(jìn)該基因的轉(zhuǎn)錄水平的作用。（hi）干擾circ-Dnmt1后Dnmt1和LC3B的表達(dá)降低，增加了細(xì)胞衰老。

3 circ-Dnmt1促進(jìn)p53和AUF1入核

圖3. circ-Dnmt1促進(jìn)p53和AUF1入核。

a. circ-Dnmt1轉(zhuǎn)染細(xì)胞能夠提高Dnmt1和LC3B的表達(dá)。b. circ-Dnmt1轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，能夠提高circ-Dnmt1在胞核和胞質(zhì)中的表達(dá)水平。c. circ-Dnmt1轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，降低p53的表達(dá)和提高腫瘤形成。d. circ-Dnmt1轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，能夠降低胞質(zhì)中的p53的表達(dá)，提高胞核中p53的表達(dá)。不影響Auf1的總體表達(dá)，但是降低胞質(zhì)中的Auf1的表達(dá)，提高胞核中Auf1的表達(dá)。e. 沉默circ-Dnmt1后能夠降低p53和Auf1的核轉(zhuǎn)錄。

4 細(xì)胞自噬能夠提高circ-Dnmt1、p53和AUF1入核

圖4. 細(xì)胞自噬與circ-Dnmt1表達(dá)水平和核定位有關(guān)。

（a-h）EBSS 和Rapamycin誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬條件下，p53和AUF1也會入核，但干擾circ-Dnmt1后，這一入核現(xiàn)象消失。這些自噬誘導(dǎo)劑還可以促進(jìn)Dnmt1和LC3B蛋白水平的增加。i. 過表達(dá)circ-Dnmt1后，circ-Dnmt1的核定位也增加。

5 circ-Dnmt1可與p53和AUF1相互作用　　

圖5. circ-Dnmt1可與p53和AUF1相互作用。

基于抗p53和AUF1的抗體RIP實(shí)驗(yàn)證明，確實(shí)存在circ-Dnmt1于兩種蛋白的相互作用。計(jì)算機(jī)模擬實(shí)驗(yàn)也佐證了這一相互作用現(xiàn)象。

6 計(jì)算機(jī)模擬證明circ-Dnmt1可與p53和AUF1相互作用　

圖6 circ-Dnmt1可與p53和AUF1相互作用位點(diǎn)驗(yàn)證。

基于計(jì)算機(jī)模擬的結(jié)果，作者設(shè)計(jì)了突變載體和反義核苷酸片段，驗(yàn)證是否可阻斷circ-Dnmt1與p53和AUF1的相互作用。突變和反義核苷酸均明顯抵消了過表達(dá)circ-Dnmt1后細(xì)胞的影響，包括增殖能力和衰老表型等。p53和AUF1的核定位也受到了影響，說明所預(yù)測的位點(diǎn)的確是circ-Dnmt1與p53和AUF1相互作用的位點(diǎn)。

至此，circ-Dnmt1在乳腺癌細(xì)胞中的作用機(jī)制已成型：高表達(dá)的circ-Dnmt1分子通過與p53和AUF1相互作用，最終三種分子均發(fā)生入核轉(zhuǎn)移，入核后的p53促進(jìn)細(xì)胞自噬相關(guān)的基因表達(dá)，入核后的AUF1蛋白不再具有抑制Dnmt1 mRNA的功能，因此促進(jìn)了Dnmt1蛋白的翻譯積累，抑制了p53的轉(zhuǎn)錄并促進(jìn)了腫瘤增殖有關(guān)的基因表達(dá)。

7 過表達(dá)circ-Dnmt1促進(jìn)腫瘤生長速度

圖7體內(nèi)分析circ-Dnmt1的功能。

皮下腫瘤模型表明過表達(dá)circ-Dnmt1后腫瘤的生長速度明顯增加。自噬誘導(dǎo)劑也可以有類似的作用，而自噬抑制劑則阻止過表達(dá)circ-Dnmt1對腫瘤生長的影響。