CircRNA通過ceRNA機制調控自噬影響腦缺血性中風

自從大隅良典因細胞自噬獲得2016年度諾貝爾生理學與醫(yī)學獎，自噬的研究熱度持續(xù)升溫。

自噬目前根據發(fā)生過程分為三類：Macroautophagy，Microautophagy和Chaperone-mediated autophagy CMA)。大自噬（Macroautophagy）即我們說的自噬（autophagy）;微自噬（Microautophagy）：是指溶酶體主動、直接吞噬胞漿成分的一種方式; 分子伴侶介導的自噬(Chaperone-mediated autophagy，CMA)：一些分子伴侶，如hsp70，能幫助未折疊蛋白轉位入溶酶體。通常說的自噬泛指Macroautophagy.

CircRNA的研究也是近幾年開始熱門起來的，下面讓我們通過一篇文章來介紹如何將這兩大熱門聯(lián)系起來。

該文為東南大學的姚紅紅教授團隊于今年6月份發(fā)表在Attophagy雜志(IF=11.1)上，題為”Novel insight into circular RNA HECTD1 in astrocyte activation via autophagy by targeting MIR142-TIPARP: Implications for cerebral ischemic stroke“, 揭示circHECTD1同過ceRNA機制調控自噬，參與腦缺血中風過程。

研究人員首先通過circRNA芯片技術在中風小鼠模型-短暫性大腦中動脈閉塞缺血性腦組織中發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA circHECTD1顯著高表達，同時在AIS中風病人的血漿樣本得到證實。敲低circHectd1表達后，可明顯減少中風小鼠模型的腦梗塞區(qū)域,減少神經毒性以及改善星形膠質細胞，進一步分子機制研究表明，circHECTD1可以通過miRNA海綿作用競爭性吸附miRNA-142,抑制miRNA-142的活性，導致TIPARP（TCDD誘導型聚[ADP-核糖]聚合酶）表達的抑制，隨后通過巨自噬/自噬抑制星形膠質細胞活化。

研究方案：

1、篩選腦缺血相關circRNA----( circHECTD1在缺血腦組織中上調)

作者首先在中風模型和對照小鼠的缺血性腦組織（n=3）,進行circRNA芯片檢測，篩選到5個上調的circRNA(Figure1 A,B,C)； 并設計divergent 和convergent引物在cDNA和gDNA上進行PCR鑒定（Figure1 D），定量PCR結果驗證了circ_008488（circHECTD1）的顯著高表達；為驗證該circ參與中風，作者在急性缺血性中風（AIS）（n=37）和健康人(n=47)血漿中通過PCR驗證circHECTD1的上調（E）。

二、 circHECTD1 功能驗證-----（干擾circHECTD1后腦梗塞降低）

為驗證其中風功能，作者將攜帶circHECTD1 siRNA的慢病毒顯微注射入小鼠側腦室(A)，驗證siRNA的傳染效果（B）和干擾circHECTD1的效果（C）,慢病毒注射2周后開始構建tMCAO模型，24小時后核磁共振檢查腦梗面積，TTC染色檢測體積，發(fā)現(xiàn)干擾circHECTD1后腦梗死面積顯著降低（D，E）; 神經缺陷得分也顯著下降（F）。

三、circHECTD1 作用機制
1.體內干擾circHECTD1后抑制星形膠質細胞活性

為研究其機制，研究者在同樣的實驗組（中風模型和對照小鼠的缺血性腦組織，n=3）,進行mRNA芯片檢檢測，發(fā)現(xiàn)515個上調和87個下調(1.5倍)mRNA（A，B，C）； 為驗證芯片結果，對GFAP進行PCR和wb檢測，驗證其高表達（D,E）; 并驗證GFAP與circHECTD1共定位（F）；為驗證circHECTD1角色，將circHectd1-siRNA-GFP注射模型小鼠，免疫熒光顯示GFAP與circHectd1-siRNA共定位（G）；腦切片免疫熒光標記星形膠質細胞標志物，顯示活性星形膠質細胞出現(xiàn)在皮質半影區(qū)（H）; 活性星形膠質細胞在circCon siRNA組中升高，但在circHectd1-siRNA組中得到改善（I,J）, WB進一步驗證GFAP在circHectd1-siRNA組中顯著降低。

2.體外干擾circHECTD1后抑制星形膠質細胞活性

作者進一步在小鼠星形膠質細胞（AS）和人膠質瘤細胞A172中檢測circHECTD1對星形膠質細胞活性的影響。

3. circHECTD1介導的星形膠質細胞活性的機制研究---- circHECTD1 結合MIR142

首先FISH對circHECTD1進行定位，發(fā)現(xiàn)主要位于細胞質，因此作者研究其是否作為ceRNA結合miRNA，RNAhybrid軟件顯示其具有MIR142結合位點（A），F(xiàn)ISH顯示兩者共定位（B），PCR顯示MIR142在AIS病人中下調 C, OGD-R處理細胞后MIR142 下調（E,F）；pull down顯示MIR142模擬五可拉下circHECTD1 (G)，circHECTD1探針可拉下MIR142 (H).

4. circHECTD1-MIR142的靶基因驗證

作者進一步研究MIR142的靶基因。通過預測發(fā)現(xiàn)MIR142可靶向TIPARP（A），熒光素酶報告基因實驗驗證其相互作用（B）； mRNA芯片（C,D） 和PCR、wb（E,F）顯示靶基因在模型小鼠中上調。免疫熒光顯示TIPARP與GFAP共定位（G）；AS和A172細胞中MIR142可下調TIPARP表達（H,I），體內干擾circHECTD1后TIPARP表達下調（J）.

5. 進一步驗證circHECTD1-MIR142-TIPARP促進星形膠質細胞活性

作者通過拯救實驗驗證這一ceRNA軸中的分子對星形膠質細胞標記物GEAP的表達的調控

6. circHECTD1對自噬的調控

越來越多的證據表明自噬參與了星形膠質細胞的激活，并參與了腦卒中的發(fā)病機制，因此作者研究circHECTD1是否通過自噬激活星形膠質細胞。首先證明星形膠質細胞激活與自噬相關：檢測OGD-R刺激上調自噬相關蛋白的表達（A,B）和自噬流信號（C）。然后證明circHECTD1影響自噬：免疫熒光顯示circHECTD1干擾后抑制OGD-R誘導MAP1LC3B的表達（D）,pcr和wb進一步驗證（E,F），體內證明circHECTD1干擾后MAP1LC3B表達降低（G）.

7. circHECTD1-MIR142 axis通過TIPARP調控自噬進而激活星形膠質細胞

circHECTD1-MIR142-TIPARP對自噬的影響：干擾circHECTD1能夠改善anti-MIR142誘導的自噬（A），過表達circHECTD1能夠改善MIR142誘導的MAP1LC3B-II下調（B）, Tiparp siRNA顯著抑制OGD-R引起的自噬（C）。進一步檢測自噬對星星價值細胞的影響：自噬抑制劑3-MA降低OGD-R引起的膠質細胞標志物GFAP和自噬標志物MAP1LC3B-II的表達（D，E），自噬激動劑rapamycin起想反作用（F,G）