由miR-18a-5p靶向的SREBP1通過與Snail和HDAC1/2形成共抑制因子復(fù)合物調(diào)節(jié)乳腺癌中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

局部乳腺癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的進(jìn)展導(dǎo)致預(yù)后不良和高死亡率。近日，發(fā)表在《Cell Death and Differentiation》上的一篇名為《SREBP1, targeted by miR-18a-5p, modulates epithelial-mesenchymal transition in breast cancer via forming a co-repressor complex with Snail and HDAC1/2》的文章探討了miRNA對腫瘤進(jìn)展的貢獻(xiàn)以及導(dǎo)致其表達(dá)改變的調(diào)節(jié)機(jī)制。使用來自親代乳腺癌細(xì)胞的高度肺轉(zhuǎn)移亞系，miRNA表達(dá)譜顯示miR-17-92簇顯著下調(diào)，miR-18a-5p是下調(diào)最明顯的。異位表達(dá)和miR-18a-5p的抑制證明了其抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)控制脂質(zhì)代謝的主要轉(zhuǎn)錄因子固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄蛋白1（SREBP1）是miR-18a-5p的候選靶標(biāo)。SREBP1過度表達(dá)并且與乳腺癌的較差臨床效果密切相關(guān)。功能上SREBP1在體外和體內(nèi)促進(jìn)乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移。為了揭示SREBP1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移的潛在機(jī)制，進(jìn)行了mRNA分析和隨后的基因集富集分析（GSEA），并證明SREBP1與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）顯著相關(guān)。此外，發(fā)現(xiàn)SREBP1介導(dǎo)的E-鈣黏蛋白抑制依賴于脫乙?；?，并且通過募集Snail/HDAC1/2阻遏復(fù)合物而增強(qiáng)。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，認(rèn)為miR-18a-5p的表達(dá)降低和伴隨的SREBP1過表達(dá)導(dǎo)致EMT狀態(tài)的誘導(dǎo)，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移?？傊?，該項(xiàng)研究揭示了miR-18a-5p和SREBP1在EMT和轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用，從而為晚期乳腺癌的針對性治療提供了有希望的藥物靶標(biāo)。

技術(shù)路線

結(jié)果
1.MiR-18a-5p被鑒定為抑制乳腺癌侵襲性的候選miRNA

圖1高度肺轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞的體內(nèi)選擇將miR-18a-5p鑒定為抑制乳腺癌侵襲的候選miRNA。

a 高度肺轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞的體內(nèi)選擇程序流程圖。將親本MDA-MB-231EGFP-Fluc從尾靜脈注射到Balb/c雌性小鼠中以形成肺轉(zhuǎn)移。八周后，收獲第一輪亞系LM-R1EGFP-fLUC，培養(yǎng)，通過流式細(xì)胞術(shù)分選并再接種到小鼠中以獲得第二輪亞系LM-R2EGFP-fLUC。b LM-R1EGFP-fLUC的典型熒光和相位對比圖像。比例尺：20 μm。c Transwell實(shí)驗(yàn)顯示MDA-MB-231EGFP-Fluc的遷移和侵襲能力在體內(nèi)選擇期間連續(xù)增加（LM-R2EGFP-fLUC> LM-R1EGFP-fLUC> MDA-MB-231EGFP-Fluc）。侵入細(xì)胞的典型區(qū)域用結(jié)晶紫染色（n = 3）。比例尺：20 μm。d MDA-MB-231EGFP-fLUC，LM-R1EGFP-fLUC和LM-R2EGFP-fLUC的差異miRNA譜的表達(dá)熱圖。e 通過qPCR檢測的miR-17-92簇中六個(gè)成員的表達(dá)與微陣列中一致（n = 3）。f Transwell實(shí)驗(yàn)顯示miR-18a-5p損害MDA-MB-231 EGFP-fLUC，LM-R1EGFP-fLUC和LM-R2EGFP-fLUC的遷移和侵襲能力（n = 3）。左，被侵襲細(xì)胞結(jié)晶紫染色的典型區(qū)域；右，三個(gè)隨機(jī)區(qū)域被侵襲細(xì)胞的相對定量。比例尺：20μm。g Transwell實(shí)驗(yàn)表明miR-18a-5p模擬物損害了MDA-MB-231和MCF-7的遷移和侵襲能力，而miR-18a-5p抑制劑提高了轉(zhuǎn)移效果（n = 3）。比例尺：20μm。* P <0.05，** P <0.01。

2.MiR-18a-5p通過直接靶向SREBP1抑制遷移和侵襲

圖2 MiR-18a-5p靶向SREBP1抑制遷移和侵襲。

a 維恩圖表示通過mRNA微陣列、miRWalk和MicroCosm鑒定的miR-18a-5p的共有候選靶基因。b miR-18a-5p模擬物處理后，通過qPCR檢測，四種候選靶標(biāo)（SREBP1，PIK3C2A，RBBP8和SLC30A7）中SREBP1的表達(dá)最明顯地被抑制（n = 3）。c MDA-MB-231，LM-R1和LM-R2中SREBP1的mRNA表達(dá)（n = 3）。d 8種生物體的miR-18a-5p在SREBP1的3'UTR上預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)的比對。突變體中相應(yīng)序列的結(jié)構(gòu)。Mut：突變體。e用0到100nM濃度梯度的miR-18a-5p模擬物共轉(zhuǎn)染SREBP1野生型或突變型3'UTR后，MDA-MB-231細(xì)胞的熒光素酶報(bào)告基因檢測（n = 3）。WT：野生型，MUT：突變型。f 用miR-18a模擬物±抑制劑共轉(zhuǎn)染SREBP1野生型3'UTR后，MDA-MB-231細(xì)胞的熒光素酶報(bào)告基因檢測（n = 3）。g Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法SREBP1的恢復(fù)可部分消除miR-18a-5誘導(dǎo)的MDA-MB-231和MCF-7中遷移和侵襲的抑制。比例尺：20μm。h 對上述細(xì)胞的遷移和侵襲進(jìn)行定量分析（n = 3）。* P <0.05，** P <0.01。

3. SREBP1表達(dá)上調(diào)并與乳腺癌的存活相關(guān)

圖3 乳腺癌中SREBP1表達(dá)上調(diào)，顯示總體存活率較低。

a 在乳腺正常組織和癌組織中SREBP1表達(dá)的免疫組化染色的典型圖像。IDC Ⅱ：侵襲性導(dǎo)管癌Ⅱ級，IDC Ⅲ：侵襲性導(dǎo)管癌Ⅲ級。b 乳腺腫瘤組織和對應(yīng)正常組織中SREBP1c mRNA表達(dá)的qPCR（n = 30對）。c 組織微陣列中329個(gè)人乳腺癌組織中SREBP1的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染色強(qiáng)度的典型免疫組化圖像。d從細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)和總SREBP1方面，對SREBP1表達(dá)高或低的患者的整體存活和特異存活進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析。

4.SREBP1在體外和體內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞生長和侵襲

圖4 SREBP1在體外和體內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞生長和侵襲。

a 通過WB驗(yàn)證穩(wěn)定敲低（左）和過表達(dá)（右）MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞系的效率。b 免疫熒光分析顯示，在MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞系中，shRNA沉默減少了細(xì)胞核中的SREBP1活性形式。DAPI用于指示核位置。比例尺：20μm。c 用SREBP1敲低或過表達(dá)載體（n = 3）穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞的Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。展示了被侵襲細(xì)胞結(jié)晶紫染色的典型區(qū)域，并對三個(gè)隨機(jī)區(qū)域的被侵襲細(xì)胞進(jìn)行了定量分析。比例尺：20μm。d 植入MDAMB-231對照細(xì)胞或穩(wěn)定的SREBP1敲低細(xì)胞（1×107）的裸鼠中異種移植腫瘤的圖像（n = 6）。e 裸鼠中SREBP1敲低和對照MDA-MB-231細(xì)胞的腫瘤生長曲線（n = 6）。f 在實(shí)驗(yàn)完成時(shí)稱量植入對照和穩(wěn)定的SREBP1敲低細(xì)胞的裸鼠的腫瘤重量（n = 3）。g 典型異種移植腫瘤的Ki67和TUNEL染色。比例尺：20μm。h SREBP1敲低后肺轉(zhuǎn)移減少（n = 7）。上：注射SREBP1敲低或?qū)φ誐DA-MB-231細(xì)胞后小鼠的全肺圖像；下：肺轉(zhuǎn)移性腫瘤的典型蘇木精和伊紅染色圖。i 原位注射SREBP1敲低或?qū)φ誐DA-MB-231細(xì)胞（n = 7）后肺表面的轉(zhuǎn)移結(jié)的定量。j 注射SREBP1敲低或?qū)φ誐DA-MB-231細(xì)胞的小鼠的存活率（n = 6）。* P <0.05，** P <0.01。

5.SREBP1通過誘導(dǎo)EMT促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移

圖5 SREBP1通過誘導(dǎo)EMT促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

a 在穩(wěn)定的SREBP1敲低和對照乳腺細(xì)胞中基于微陣列的差異基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄分析。b 基因集富集分析顯示富含SREBP1的細(xì)胞與MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中的EMT基因列表顯著相關(guān)。c 用對照載體或shSREBP1載體轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白和纖連蛋白表達(dá)的免疫熒光分析。DAPI用于指示核位置。比例尺：20μm。d 用對照載體和shSREBP載體轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中EMT相關(guān)標(biāo)志物的mRNA水平（n = 3）。e SREBP1敲低后的MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中EMT相關(guān)標(biāo)志物的WB結(jié)果。* P <0.05，** P <0.01。

圖6 臨床樣本中SREBP1表達(dá)與EMT標(biāo)記顯著相關(guān)。

a 通過qPCR方法研究SREBP1表達(dá)與EMT相關(guān)標(biāo)志物（E-鈣黏蛋白，N-鈣黏蛋白和纖連蛋白）之間的相關(guān)性（n = 3）。根據(jù)表達(dá)水平中值對SREBP1進(jìn)行分層定義“高”和“低”表達(dá)水平。b 通過免疫組化染色檢測對照和shSREBP1異種移植腫瘤中SREBP1，E-鈣黏蛋白，N-鈣黏蛋白和纖連蛋白的表達(dá)。比例尺：20μm。c 總體存活和特異性存活的Kaplan-Meier生存分析表明，SREBP1 mRNA與E-鈣黏蛋白mRNA結(jié)合可預(yù)測乳腺癌患者存活結(jié)果。* P <0.05，** P <0.01。

6.SREBP1通過與HDAC1/2和Snail形成共抑制因子復(fù)合物來調(diào)節(jié)EMT以抑制E-鈣黏蛋白

圖7 SREBP1通過與HDAC1/2和Snail形成共抑制因子復(fù)合物抑制E-鈣黏蛋白來調(diào)節(jié)EMT。

a 當(dāng)用SREBP1過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MDA-MB-231 48小時(shí)再用0 nM、100 nM和300nM TSA處理后，通過qPCR檢測E-鈣黏蛋白表達(dá)的mRNA表達(dá)（n = 3）。b 先用0 nM、100 nM和300nM TSA處理MDA-MB-231 48小時(shí)再用SREBP1過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后，用qPCR檢測E-鈣黏蛋白表達(dá)的mRNA表達(dá)（n = 3）。c 通過熒光素酶報(bào)告基因檢測確定Snail存在或不存在的情況下SREBP1對E-鈣黏蛋白啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄抑制作用（n = 3）。d 通過co-IP檢測觀察到SREBP1與Snail和HDAC1/2的物理相互作用。e 熒光素酶報(bào)告基因檢測驗(yàn)證Snail/HDAC1/2促進(jìn)SREBP1對E-鈣黏蛋白表達(dá)的抑制作用（n = 3）。f ChIP-qPCR檢測證實(shí)SREBP1/Snail/HDAC1/2向E-鈣黏蛋白啟動(dòng)子募集。SREBP1沉默不影響Snail，HDAC1和HDAC2向E-鈣黏蛋白啟動(dòng)子募集（左），而Snail的沉默顯著解離了E-鈣黏蛋白啟動(dòng)子的Snail，SREBP1和HDAC1/2（中）。HDAC1和HDAC2的同時(shí)敲低不會(huì)妨礙Snail以及SREBP1向啟動(dòng)子區(qū)域的募集（右）。g miR-18a-5p靶向SREBP1抑制SNAIL/HDAC1/2誘導(dǎo)的EMT和乳腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制示意圖。* P <0.05，** P <0.01。