血清外泌體介導(dǎo)精氨酸酶1作為糖尿病內(nèi)皮功能障礙的新機(jī)制

內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙在糖尿病血管疾病中起著至關(guān)重要的作用，但其機(jī)制尚不完全清楚。外泌體通過在細(xì)胞間傳遞分子參與細(xì)胞通信。內(nèi)皮細(xì)胞對血清外泌體的反應(yīng)以及糖尿病相關(guān)血管疾病影響還沒有相關(guān)報道。7月17日香港中文大學(xué)深圳研究所黃聿研究組在Proc Natl Acad Sci USA（IF=9.5）上發(fā)表論文，他們通過對糖尿病Db／Db小鼠血清中的外泌體進(jìn)行純化和鑒定，觀察到這些性激素進(jìn)入非完整糖尿病大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮依賴性舒張功能受損。進(jìn)一步的研究表明，外周體精氨酸酶1最有可能成為糖尿病血管疾病的調(diào)節(jié)劑。

技術(shù)路線

研究結(jié)果
1.dp/dp 小鼠血清中分離的外泌體進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞。

圖1.外泌的分離及其被內(nèi)皮細(xì)胞吸收。

A.外泌體電鏡鑒定。B.外泌體粒徑密度分布分析。C.WB鑒定外泌體。D.PKH67和DAPI染色檢測外泌體被內(nèi)皮細(xì)胞吸收的情況。

2.從糖尿病小鼠中分離出的外泌體對非糖尿病小鼠動脈的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生損害。

圖2. 從dp/dp小鼠中分離出的外泌體對dp/m+小鼠動脈的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生損害。

A. dp/dp小鼠血清外泌體高于dp/m+小鼠。B. 糖尿病小鼠血清外泌體的含量高于非糖尿病小鼠。C、D.外泌體抑制乙酰膽堿誘導(dǎo)的主動脈內(nèi)皮依賴性舒張。E外泌體減弱了腸系膜動脈的內(nèi)皮依賴性舒張。F. dp/dp和dp/m+來源的外泌體尾部注射入dp/m+小鼠，dp/dp 小鼠來源的外泌體對內(nèi)皮依賴性舒張產(chǎn)生損害。G. PKH和DAPI染色顯示肝素可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞對外泌體的吸收。H.肝素改善dp/dp小鼠外泌體誘發(fā)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。

3.dp/dp小鼠外泌體中的外泌體蛋白在誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙中起到了重要的作用。

圖3. 外泌體蛋白在誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙中起到了重要的作用。

A. 去除dp/dp小鼠的外泌體中蛋白質(zhì)和RNA。B.電鏡檢測外泌體。C. WB檢測外泌體。D.PCR分析不同方法處理后外泌體中各種miRNA的水平。E.外泌體中的蛋白質(zhì)而不是RNA造成的血管內(nèi)皮功能障礙。

4.dp/dp小鼠外泌體介導(dǎo)的精氨酸1（ARG1）水平的升高可以介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，且外泌體中的精氨酸1可以減少內(nèi)皮細(xì)胞中NO的生成。

圖4.糖尿病小鼠外泌體介導(dǎo)的ARG 1增加，并且參與了dp/dp小鼠外泌體對內(nèi)皮細(xì)胞功能的損害。

A.WB檢測外泌體相關(guān)蛋白。B.WB檢測外泌體中Arg1和CD63蛋白的表達(dá)。C.外泌體中Arg1的活性要高于血清中的Arg1活性。D. dp/dp小鼠外泌體加入Arg1抑制劑于dp/m+小鼠的主動脈中。E.WB檢測Arg1蛋白。F. dp/dp小鼠外泌體處理后精氨酸和鳥氨酸水平的檢測。G. dp/dp小鼠外泌體處理后可以減少NO的產(chǎn)生。

5.在dp/dp小鼠內(nèi)皮細(xì)胞中，外泌體是Arg1的主要來源。

圖5. dp/dp小鼠和dp/dm+小鼠Arg1 蛋白和基因的表達(dá)。

A.熒光染色檢測dp/dp小鼠和dp/dm+小鼠Arg1 蛋白表達(dá)。B. qPCR分析顯示dB/m +和dB/db小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中Arg1和Arg2的mRNA表達(dá)水平。C. 在原位雜交中發(fā)現(xiàn)的db/db或db/m+肝、脾和主動脈的內(nèi)源性Arg1表達(dá)。D.加入外泌體抑制劑后檢測Arg1的表達(dá)。E. 用Arg1-shRNA體外敲除Arg1并不能挽救db／db小鼠主動脈內(nèi)皮功能。F. 敲除Arg1-shRNA對db/db外泌體誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙的影響。

6.ARG1敲除恢復(fù)了db/db小鼠的內(nèi)皮細(xì)胞功能。

圖6.敲除Arg1提高db/db小鼠的EDRS。

A. 免疫熒光圖像顯示，在db/db小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中Arg1蛋白表達(dá)。B. 敲除Arg1可以恢復(fù)血管依賴性舒張。C、D：敲除Arg1增加了db/db小鼠主動脈的亞硝酸鹽水平。E.WB檢測Arg1蛋白表達(dá)。F. 敲除Arg1后的db/db小鼠外泌體注射入dB/m +小鼠，其EDRS功能沒有損害。

7.體內(nèi)ARG1過表達(dá)導(dǎo)致db/m+小鼠內(nèi)皮功能障礙。

圖7.Arg1過度表達(dá)損害db/m+小鼠內(nèi)皮功能。

A. 免疫熒光圖像顯示在db/M+小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中ARG1蛋白表達(dá)。B、C、D Arg1過度表達(dá)減弱EDRS，這種效應(yīng)可以被L-精氨酸逆轉(zhuǎn)。E.WB檢測Arg1和CD63蛋白水平。F. 從AG1過度表達(dá)的db/m+小鼠中分離出的外泌體蛋白在4~8小時孵育后，db/m+小鼠主動脈中觸發(fā)內(nèi)皮功能障礙。G. 外泌體在糖尿病相關(guān)內(nèi)皮功能障礙中的作用。