乳腺癌中XIST下調(diào)可以激活MSN-c-Met信號(hào)通路并且低表達(dá)XIST乳腺癌來(lái)源的外泌體miR-503能夠重新編碼小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,最終促進(jìn)乳腺癌的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移的發(fā)生

欄目:最新研究動(dòng)態(tài) 發(fā)布時(shí)間:2018-09-05
高于30%的轉(zhuǎn)移性乳腺癌病人最終會(huì)發(fā)展成為顱內(nèi)轉(zhuǎn)移,但是這是如何發(fā)展的,其病理機(jī)制還不是很清楚......

高于30%的轉(zhuǎn)移性乳腺癌病人最終會(huì)發(fā)展成為顱內(nèi)轉(zhuǎn)移,但是這是如何發(fā)展的,其病理機(jī)制還不是很清楚。鑒于此,Kounosuke Watabe教授帶領(lǐng)其團(tuán)隊(duì)探究了乳腺癌的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移的過(guò)程,并于2018年7月19日發(fā)表于Cancer Research雜志(IF=9.1)。本次研究首先在原發(fā)性乳腺癌組織和乳腺癌的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移腫瘤組織做了lncRNA表達(dá)譜,并發(fā)現(xiàn)X-inactive–specific transcript(XIST)在這兩種組織中下調(diào)最顯著。然后作者進(jìn)行了XIST功能的探究,發(fā)現(xiàn)XIST表達(dá)水平與顱內(nèi)轉(zhuǎn)移存在負(fù)相關(guān)性,但是與骨轉(zhuǎn)移沒(méi)有相關(guān)性。當(dāng)沉默XIST后能夠優(yōu)先促進(jìn)異種移植模型中的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤的生長(zhǎng)。進(jìn)一步,作者在小鼠乳腺中特異性敲除XIST,發(fā)現(xiàn)這能加速原發(fā)性乳腺癌腫瘤的生長(zhǎng)和顱內(nèi)轉(zhuǎn)移的發(fā)生。同時(shí),下調(diào)XIST能夠通過(guò)MSN調(diào)節(jié)蛋白刺激上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)和激活c-Met,這便會(huì)增加腫瘤細(xì)胞多能性。下調(diào)XIST也能夠分泌攜帶miR-503的外泌體,這能夠啟動(dòng)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞M1-M2的極化。M1-M2的改變能夠增加小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中免疫抑制因子的表達(dá),最終抑制T細(xì)胞的增殖。作者又進(jìn)一步篩選了FDA-批準(zhǔn)的藥物庫(kù),并且識(shí)別了氟達(dá)拉濱可以作為低表達(dá)XIST的乳腺癌的合成致命藥物,并且還發(fā)現(xiàn)氟達(dá)拉濱能夠在小鼠模型中抑制乳腺癌的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移。

這篇文章的結(jié)果揭示了XIST通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境,最終在乳腺癌的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移中具有關(guān)鍵性的作用。同時(shí),XIST調(diào)節(jié)的信號(hào)通路也可能作為治療乳腺癌的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移的有效靶點(diǎn)。


技術(shù)路線

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結(jié)果
1. XIST在乳腺癌的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移中的表達(dá)是下調(diào)的。

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圖1. X染色體上的XIST的下調(diào)與顱內(nèi)轉(zhuǎn)移正相關(guān)。

A. 樣品示意圖和lncRNA分析(原發(fā)性乳腺癌組織點(diǎn)(n=11)、乳腺癌的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移組織點(diǎn)(n=13)被切下,顯微切割去得到腫瘤細(xì)胞,提取RNA,檢測(cè)92個(gè)關(guān)鍵的與癌癥相關(guān)的lncRNA)。B. TaqMan PCR檢測(cè)XIST在臨床樣本中的表達(dá)。 C. qPCR檢測(cè)在兩對(duì)優(yōu)先轉(zhuǎn)移顱內(nèi)的細(xì)胞系中XIST的表達(dá)。D. 通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù),Kaplan–Meier分析顱內(nèi)轉(zhuǎn)移的病人與死亡的關(guān)系(n=710)。E. 通過(guò)GSE14018數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移乳腺癌病人中XIST的表達(dá)。F. 通過(guò)TCGA據(jù)庫(kù)檢測(cè)亞型乳腺癌病人中XIST的表達(dá)。

2. 在體內(nèi),XIST優(yōu)先抑制腫瘤的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移。

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圖2. 在體內(nèi),下調(diào)XIST能夠促進(jìn)腫瘤的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移。

A-H. 正?;蛳抡{(diào)XIST的MCF7和SKBR3注射到小鼠心臟中。qPCR檢測(cè)MCF7和SKBR3細(xì)胞下調(diào)XIST的效率(A、E)。下調(diào)XIST后,每一周檢測(cè)一次luciferase信號(hào)反應(yīng)腫瘤生長(zhǎng)情況(B、F)。Kaplan–Meier分析顱內(nèi)轉(zhuǎn)移和生存之間的關(guān)系(C、G)。28天后處死小鼠,大腦內(nèi)的luciferase信號(hào)被檢測(cè)(D、H)。I. qPCR檢測(cè)231BrM-dXIST#11的表達(dá)。 J-L. 通過(guò)心臟注射,將231BrM-dCTRL和231BrM-dXIST#11細(xì)胞接種到裸鼠體內(nèi),監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)(J)。Kaplan–Meier分析顱內(nèi)轉(zhuǎn)移和生存之間的關(guān)系(K)。28天后處死小鼠,大腦內(nèi)的luciferase信號(hào)被檢測(cè)(L)。M. 正常或下調(diào)XIST的MCF7和ZR75-1細(xì)胞原位移植裸鼠乳房脂肪墊中,通過(guò)BLI檢測(cè)原發(fā)性腫瘤的生長(zhǎng)。N. 移植5周后檢測(cè)顱內(nèi)轉(zhuǎn)移發(fā)生率。O. 通過(guò)心臟注射將MCF7-shCTRL 和 MCF7-shXIST細(xì)胞轉(zhuǎn)移到裸鼠大腦中,通過(guò)lVlS檢測(cè)腫瘤生長(zhǎng)。P. 來(lái)自腫瘤模型的小鼠的大腦的量化。

3. 乳腺特異性敲除XIST能夠提高顱內(nèi)轉(zhuǎn)移。

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圖3. 在MMTV-PyMT模型中敲除XIST后促進(jìn)顱內(nèi)轉(zhuǎn)移。

A. 正常表達(dá)和敲除XIST的乳腺的圖片(Age=3W)。B. A圖中乳房的腫瘤結(jié)節(jié)被統(tǒng)計(jì)。C. 20周后計(jì)算腫瘤的體積。D. IHC檢測(cè)來(lái)自正常表達(dá)和敲除XIST的PyMT小鼠的原發(fā)性腫瘤中CK14和CK8/18的表達(dá)。E. 正常表達(dá)和敲除XIST的MMTV-PyMT的腫瘤遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移率。F. 24-28周,ICH檢測(cè)CK14和mT-抗原顯示腫瘤的微轉(zhuǎn)移率。G. 小鼠大腦微轉(zhuǎn)移的數(shù)量。H. qPCR檢測(cè)mT-抗原在小鼠大腦中的表達(dá)。I. Kaplan–Meier 分析顱內(nèi)轉(zhuǎn)移和Py216 and Py222細(xì)胞孵育的C57/B6小鼠生存率的關(guān)系。J. 28天后處死小鼠,大腦內(nèi)的luciferase信號(hào)被檢測(cè)。K. 蘇木精和尹紅染色孵育Py222細(xì)胞的小鼠顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤。

4.下調(diào)XIST能夠促進(jìn)腫瘤EMT和多能性。

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圖4.下調(diào)XIST啟動(dòng)子促進(jìn)腫瘤EMT和多能性。

A. MCF7-shXIST 和 ZR75-1-shXIST細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上改變的圖片。B-E. qPCR(B)、WB(C)、免疫組化(D)檢測(cè)EMT marker(E-cadherin 和vimentin)。E. 正常表達(dá)或下調(diào)的XIST后7天的MCF7 和ZR75-1細(xì)胞的形態(tài)學(xué)圖片(左),球體的數(shù)量被統(tǒng)計(jì)(右)。F. 通過(guò)將MCF7-shCTRL和MCF7-shXIST細(xì)胞注射到裸鼠乳腺脂肪墊中,進(jìn)行有限稀釋實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤啟動(dòng)能力和測(cè)量腫瘤的形成。G. 正常表達(dá)或下調(diào)XIST的 MCF7 和 ZR75-1細(xì)胞進(jìn)行移行分析實(shí)驗(yàn)。

5.下調(diào)XIST能夠通過(guò)MSN的上調(diào)激活c-Met信號(hào)通路。

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圖5. XIST通過(guò)MSN調(diào)節(jié)c-Met的表達(dá)。

A. 在TCGA中乳腺癌病人被分為高表達(dá)XIST(高于30%)組和低表達(dá)XIST(低于30%)組,然后進(jìn)行GSEA對(duì)119個(gè)促癌通路進(jìn)行分析。結(jié)果顯示HGF/c-Met通路的富集程度最高。B. WB檢測(cè)正常表達(dá)或下調(diào)XIST的3種不同的乳腺癌細(xì)胞系中c-Met的表達(dá)。C. 在發(fā)生顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤的病人中,TaqMan qPCR檢測(cè)XIST的表達(dá),IHC檢測(cè)c-Met蛋白的表達(dá)。通過(guò)卡方計(jì)算2 XIST表達(dá)和c-Met表達(dá)的相關(guān)性。D. MCF7-shCTRL 和MCF7-shXIST 細(xì)胞的表達(dá)譜分析的流程圖。E. qPCR檢測(cè)MCF7-shCTRL 和MCF7-shXIST細(xì)胞中MSN、MID1 和MPP1的表達(dá)。F.在MCF7-shXIST 和SKBR3-shXIST細(xì)胞中下調(diào)MSN后,WB檢測(cè)MSN和c-Met的表達(dá)。G. 免疫組化檢測(cè)正常表達(dá)或下調(diào)XIST或MSN的MCF7細(xì)胞。H. 在231BrM細(xì)胞中下調(diào)MSN后,WB檢測(cè)MSN和c-Met的表達(dá)。J. WB檢測(cè)正常表達(dá)或下調(diào)XIST的231BrM和SKBrM3細(xì)胞中c-Met和MSN的表達(dá)。K. 免疫組化檢測(cè)正常表達(dá)或下調(diào)XIST的231BrM細(xì)胞。L. WB檢測(cè)加或不加四環(huán)素的MCF7-shXIST/Dox/sh-Met細(xì)胞中 c-Met的表達(dá)。M. 加或不加四環(huán)素的MCF7-shXIST/Dox/sh-Met細(xì)胞進(jìn)行移行實(shí)驗(yàn)。N. 進(jìn)行小鼠心臟接種MCF7-shXIST/Dox/sh-Met細(xì)胞,并且進(jìn)行四環(huán)素治療(將四環(huán)素加到小鼠的引用水中),分析大腦(左)和骨骼(右)內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤和生存的關(guān)系。O. 最后進(jìn)行BLI拍照。P. 來(lái)自于大腦和骨骼的內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤小鼠模型中BLI的定量。

6.在腦中,低表達(dá)XIST的細(xì)胞能夠分泌攜帶miR-503的外泌體,進(jìn)一步重編碼小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。

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圖6. 來(lái)自低表達(dá)XIST細(xì)胞的外泌體能夠攜帶miR-503逆轉(zhuǎn)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞從M1-M2極性表型的改變。

A.在低表達(dá)和高表達(dá)XIST的病人中,通過(guò)GSEA檢測(cè)了來(lái)自MSigDB數(shù)據(jù)庫(kù)的95個(gè)與免疫相關(guān)的信號(hào)通路。先天性免疫富集程度最高。C. qPCR檢測(cè)加入或不加入外泌體的SIM-A9細(xì)胞中(小鼠小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系)CD86和ARG1的表達(dá)。D. 外泌體miRNA的表達(dá)譜分析流程圖。E. TaqMan-qPCR檢測(cè)正常表達(dá)或下調(diào)XIST的兩對(duì)肺癌細(xì)胞系中miR-503的表達(dá)情況。F. 從MCF-shXIST細(xì)胞培養(yǎng)基中分離外泌體然后進(jìn)行含有PalmGFP的慢病毒載體進(jìn)行熒光標(biāo)記。外泌體共孵育SIM-A9細(xì)胞,檢測(cè)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的GFP熒光。G. 在患有乳腺癌的病人中,使用GSE22220數(shù)據(jù)庫(kù)在復(fù)發(fā)和生存之見(jiàn)檢測(cè)miR-503的表達(dá)。H. 使用Exoquick試劑盒提取發(fā)生顱內(nèi)轉(zhuǎn)移和未發(fā)生顱內(nèi)轉(zhuǎn)移的病人的血清中提取外泌體。提取外泌體中的RNA后,進(jìn)行TaqMan qPCR檢測(cè)miR-503的表達(dá)。I. 從MCF7-shCTRL, MCF7-shXIST 和MCF7-shXIST/Anti-miR503細(xì)胞的上清液中提取外泌體,孵育SIM-A9細(xì)胞后,qPCR檢測(cè)M1(CD86)和M2(CD204,ARG1)的markers。J. qPCR檢測(cè)表達(dá)或不表達(dá)miR-503的SIM-A9細(xì)胞中的M1(CD74,CD80,CD86)和M2(CD204,ARG1/2,IL10)的 markers。K. WB檢測(cè)表達(dá)或不表達(dá)miR-503的SIM-A9細(xì)胞中p-STAT3, STAT3, p-p65 和p65。L. WB檢測(cè)加入或不加入miR-503的SIM-A9細(xì)胞和人小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(HMC-3)中PD-L1的表達(dá)。M. IHC檢測(cè)乳腺癌的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤中PD-L1和IBA-1的表達(dá)。N. 加入或不加miR-503的SIM-A9與來(lái)自小鼠脾臟組織的祖T細(xì)胞共培養(yǎng)后,CFSE實(shí)驗(yàn)研究T細(xì)胞的增殖。

7.氟達(dá)拉濱能夠抑制低表達(dá)XIST腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

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圖7. 氟達(dá)拉濱能夠抑制低表達(dá)XIST乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

A.在正常表達(dá)或下調(diào)XIST的MCF7細(xì)胞中,通過(guò)MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FAD批準(zhǔn)的藥物庫(kù)和化學(xué)藥物庫(kù)(分別包含1250和140個(gè)化合物)。B. 用不同濃度的氟達(dá)拉濱處理MCF7-shCTRL和MCF7-shXIST細(xì)胞進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)。C. 用不同濃度的氟達(dá)拉濱處理差異表達(dá)XIST的癌癥細(xì)胞系。D. 在正常表達(dá)或下調(diào)XIST的231BrM細(xì)胞中進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)。E. 通過(guò)心臟注射,將MCF7-shXIST細(xì)胞注射到裸鼠體內(nèi)后,進(jìn)行氟達(dá)拉濱不處理或處理后,lVlS檢測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)。F. Kaplan–Meier分析E中顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤和生存之間的關(guān)系。G. 用氟達(dá)拉濱處理或不處理的小鼠顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤進(jìn)行HE染色。H. 在顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤中XIST的下游效應(yīng)。在癌癥細(xì)胞中下調(diào)XIST能夠促進(jìn)EMT、通過(guò)MSN上調(diào)c-Met信號(hào)通路、外泌體分泌的miR-503上調(diào)。外泌體miR-503能夠激活小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞并啟動(dòng)M1-M2的極性轉(zhuǎn)換,這能夠抑制T細(xì)胞的活性。