乳腺癌中XIST下調(diào)可以激活MSN-c-Met信號(hào)通路并且低表達(dá)XIST乳腺癌來源的外泌體miR-503能夠重新編碼小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，最終促進(jìn)乳腺癌的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移的發(fā)生

高于30%的轉(zhuǎn)移性乳腺癌病人最終會(huì)發(fā)展成為顱內(nèi)轉(zhuǎn)移，但是這是如何發(fā)展的，其病理機(jī)制還不是很清楚。鑒于此，Kounosuke Watabe教授帶領(lǐng)其團(tuán)隊(duì)探究了乳腺癌的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移的過程，并于2018年7月19日發(fā)表于Cancer Research雜志（IF=9.1）。本次研究首先在原發(fā)性乳腺癌組織和乳腺癌的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移腫瘤組織做了lncRNA表達(dá)譜，并發(fā)現(xiàn)X-inactive–specific transcript（XIST）在這兩種組織中下調(diào)最顯著。然后作者進(jìn)行了XIST功能的探究，發(fā)現(xiàn)XIST表達(dá)水平與顱內(nèi)轉(zhuǎn)移存在負(fù)相關(guān)性，但是與骨轉(zhuǎn)移沒有相關(guān)性。當(dāng)沉默XIST后能夠優(yōu)先促進(jìn)異種移植模型中的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤的生長。進(jìn)一步，作者在小鼠乳腺中特異性敲除XIST，發(fā)現(xiàn)這能加速原發(fā)性乳腺癌腫瘤的生長和顱內(nèi)轉(zhuǎn)移的發(fā)生。同時(shí)，下調(diào)XIST能夠通過MSN調(diào)節(jié)蛋白刺激上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT）和激活c-Met，這便會(huì)增加腫瘤細(xì)胞多能性。下調(diào)XIST也能夠分泌攜帶miR-503的外泌體，這能夠啟動(dòng)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞M1-M2的極化。M1-M2的改變能夠增加小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中免疫抑制因子的表達(dá)，最終抑制T細(xì)胞的增殖。作者又進(jìn)一步篩選了FDA-批準(zhǔn)的藥物庫，并且識(shí)別了氟達(dá)拉濱可以作為低表達(dá)XIST的乳腺癌的合成致命藥物，并且還發(fā)現(xiàn)氟達(dá)拉濱能夠在小鼠模型中抑制乳腺癌的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移。

這篇文章的結(jié)果揭示了XIST通過影響腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境，最終在乳腺癌的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移中具有關(guān)鍵性的作用。同時(shí)，XIST調(diào)節(jié)的信號(hào)通路也可能作為治療乳腺癌的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移的有效靶點(diǎn)。

技術(shù)路線

結(jié)果
1. XIST在乳腺癌的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移中的表達(dá)是下調(diào)的。

圖1. X染色體上的XIST的下調(diào)與顱內(nèi)轉(zhuǎn)移正相關(guān)。

A. 樣品示意圖和lncRNA分析（原發(fā)性乳腺癌組織點(diǎn)（n=11）、乳腺癌的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移組織點(diǎn)（n=13）被切下，顯微切割去得到腫瘤細(xì)胞，提取RNA，檢測92個(gè)關(guān)鍵的與癌癥相關(guān)的lncRNA）。B. TaqMan PCR檢測XIST在臨床樣本中的表達(dá)。 C. qPCR檢測在兩對優(yōu)先轉(zhuǎn)移顱內(nèi)的細(xì)胞系中XIST的表達(dá)。D. 通過GEO數(shù)據(jù)庫，Kaplan–Meier分析顱內(nèi)轉(zhuǎn)移的病人與死亡的關(guān)系（n=710）。E. 通過GSE14018數(shù)據(jù)庫檢測發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移乳腺癌病人中XIST的表達(dá)。F. 通過TCGA據(jù)庫檢測亞型乳腺癌病人中XIST的表達(dá)。

2. 在體內(nèi)，XIST優(yōu)先抑制腫瘤的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移。

圖2. 在體內(nèi)，下調(diào)XIST能夠促進(jìn)腫瘤的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移。

A-H. 正?；蛳抡{(diào)XIST的MCF7和SKBR3注射到小鼠心臟中。qPCR檢測MCF7和SKBR3細(xì)胞下調(diào)XIST的效率（A、E）。下調(diào)XIST后，每一周檢測一次luciferase信號(hào)反應(yīng)腫瘤生長情況（B、F）。Kaplan–Meier分析顱內(nèi)轉(zhuǎn)移和生存之間的關(guān)系（C、G）。28天后處死小鼠，大腦內(nèi)的luciferase信號(hào)被檢測（D、H）。I. qPCR檢測231BrM-dXIST#11的表達(dá)。 J-L. 通過心臟注射，將231BrM-dCTRL和231BrM-dXIST#11細(xì)胞接種到裸鼠體內(nèi)，監(jiān)測腫瘤生長（J）。Kaplan–Meier分析顱內(nèi)轉(zhuǎn)移和生存之間的關(guān)系（K）。28天后處死小鼠，大腦內(nèi)的luciferase信號(hào)被檢測（L）。M. 正?；蛳抡{(diào)XIST的MCF7和ZR75-1細(xì)胞原位移植裸鼠乳房脂肪墊中，通過BLI檢測原發(fā)性腫瘤的生長。N. 移植5周后檢測顱內(nèi)轉(zhuǎn)移發(fā)生率。O. 通過心臟注射將MCF7-shCTRL 和 MCF7-shXIST細(xì)胞轉(zhuǎn)移到裸鼠大腦中，通過lVlS檢測腫瘤生長。P. 來自腫瘤模型的小鼠的大腦的量化。

3. 乳腺特異性敲除XIST能夠提高顱內(nèi)轉(zhuǎn)移。

圖3. 在MMTV-PyMT模型中敲除XIST后促進(jìn)顱內(nèi)轉(zhuǎn)移。

A. 正常表達(dá)和敲除XIST的乳腺的圖片（Age=3W）。B. A圖中乳房的腫瘤結(jié)節(jié)被統(tǒng)計(jì)。C. 20周后計(jì)算腫瘤的體積。D. IHC檢測來自正常表達(dá)和敲除XIST的PyMT小鼠的原發(fā)性腫瘤中CK14和CK8/18的表達(dá)。E. 正常表達(dá)和敲除XIST的MMTV-PyMT的腫瘤遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移率。F. 24-28周，ICH檢測CK14和mT-抗原顯示腫瘤的微轉(zhuǎn)移率。G. 小鼠大腦微轉(zhuǎn)移的數(shù)量。H. qPCR檢測mT-抗原在小鼠大腦中的表達(dá)。I. Kaplan–Meier 分析顱內(nèi)轉(zhuǎn)移和Py216 and Py222細(xì)胞孵育的C57/B6小鼠生存率的關(guān)系。J. 28天后處死小鼠，大腦內(nèi)的luciferase信號(hào)被檢測。K. 蘇木精和尹紅染色孵育Py222細(xì)胞的小鼠顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤。

4.下調(diào)XIST能夠促進(jìn)腫瘤EMT和多能性。

圖4.下調(diào)XIST啟動(dòng)子促進(jìn)腫瘤EMT和多能性。

A. MCF7-shXIST 和 ZR75-1-shXIST細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上改變的圖片。B-E. qPCR（B）、WB（C）、免疫組化（D）檢測EMT marker（E-cadherin 和vimentin）。E. 正常表達(dá)或下調(diào)的XIST后7天的MCF7 和ZR75-1細(xì)胞的形態(tài)學(xué)圖片（左），球體的數(shù)量被統(tǒng)計(jì)（右）。F. 通過將MCF7-shCTRL和MCF7-shXIST細(xì)胞注射到裸鼠乳腺脂肪墊中，進(jìn)行有限稀釋實(shí)驗(yàn)檢測腫瘤啟動(dòng)能力和測量腫瘤的形成。G. 正常表達(dá)或下調(diào)XIST的 MCF7 和 ZR75-1細(xì)胞進(jìn)行移行分析實(shí)驗(yàn)。

5.下調(diào)XIST能夠通過MSN的上調(diào)激活c-Met信號(hào)通路。

圖5. XIST通過MSN調(diào)節(jié)c-Met的表達(dá)。

A. 在TCGA中乳腺癌病人被分為高表達(dá)XIST（高于30%）組和低表達(dá)XIST（低于30%）組，然后進(jìn)行GSEA對119個(gè)促癌通路進(jìn)行分析。結(jié)果顯示HGF/c-Met通路的富集程度最高。B. WB檢測正常表達(dá)或下調(diào)XIST的3種不同的乳腺癌細(xì)胞系中c-Met的表達(dá)。C. 在發(fā)生顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤的病人中，TaqMan qPCR檢測XIST的表達(dá)，IHC檢測c-Met蛋白的表達(dá)。通過卡方計(jì)算2 XIST表達(dá)和c-Met表達(dá)的相關(guān)性。D. MCF7-shCTRL 和MCF7-shXIST 細(xì)胞的表達(dá)譜分析的流程圖。E. qPCR檢測MCF7-shCTRL 和MCF7-shXIST細(xì)胞中MSN、MID1 和MPP1的表達(dá)。F.在MCF7-shXIST 和SKBR3-shXIST細(xì)胞中下調(diào)MSN后，WB檢測MSN和c-Met的表達(dá)。G. 免疫組化檢測正常表達(dá)或下調(diào)XIST或MSN的MCF7細(xì)胞。H. 在231BrM細(xì)胞中下調(diào)MSN后，WB檢測MSN和c-Met的表達(dá)。J. WB檢測正常表達(dá)或下調(diào)XIST的231BrM和SKBrM3細(xì)胞中c-Met和MSN的表達(dá)。K. 免疫組化檢測正常表達(dá)或下調(diào)XIST的231BrM細(xì)胞。L. WB檢測加或不加四環(huán)素的MCF7-shXIST/Dox/sh-Met細(xì)胞中 c-Met的表達(dá)。M. 加或不加四環(huán)素的MCF7-shXIST/Dox/sh-Met細(xì)胞進(jìn)行移行實(shí)驗(yàn)。N. 進(jìn)行小鼠心臟接種MCF7-shXIST/Dox/sh-Met細(xì)胞，并且進(jìn)行四環(huán)素治療（將四環(huán)素加到小鼠的引用水中），分析大腦（左）和骨骼（右）內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤和生存的關(guān)系。O. 最后進(jìn)行BLI拍照。P. 來自于大腦和骨骼的內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤小鼠模型中BLI的定量。

6.在腦中，低表達(dá)XIST的細(xì)胞能夠分泌攜帶miR-503的外泌體，進(jìn)一步重編碼小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。

圖6. 來自低表達(dá)XIST細(xì)胞的外泌體能夠攜帶miR-503逆轉(zhuǎn)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞從M1-M2極性表型的改變。

A.在低表達(dá)和高表達(dá)XIST的病人中，通過GSEA檢測了來自MSigDB數(shù)據(jù)庫的95個(gè)與免疫相關(guān)的信號(hào)通路。先天性免疫富集程度最高。C. qPCR檢測加入或不加入外泌體的SIM-A9細(xì)胞中（小鼠小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系）CD86和ARG1的表達(dá)。D. 外泌體miRNA的表達(dá)譜分析流程圖。E. TaqMan-qPCR檢測正常表達(dá)或下調(diào)XIST的兩對肺癌細(xì)胞系中miR-503的表達(dá)情況。F. 從MCF-shXIST細(xì)胞培養(yǎng)基中分離外泌體然后進(jìn)行含有PalmGFP的慢病毒載體進(jìn)行熒光標(biāo)記。外泌體共孵育SIM-A9細(xì)胞，檢測小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的GFP熒光。G. 在患有乳腺癌的病人中，使用GSE22220數(shù)據(jù)庫在復(fù)發(fā)和生存之見檢測miR-503的表達(dá)。H. 使用Exoquick試劑盒提取發(fā)生顱內(nèi)轉(zhuǎn)移和未發(fā)生顱內(nèi)轉(zhuǎn)移的病人的血清中提取外泌體。提取外泌體中的RNA后，進(jìn)行TaqMan qPCR檢測miR-503的表達(dá)。I. 從MCF7-shCTRL, MCF7-shXIST 和MCF7-shXIST/Anti-miR503細(xì)胞的上清液中提取外泌體，孵育SIM-A9細(xì)胞后，qPCR檢測M1(CD86)和M2(CD204,ARG1)的markers。J. qPCR檢測表達(dá)或不表達(dá)miR-503的SIM-A9細(xì)胞中的M1(CD74,CD80,CD86)和M2(CD204,ARG1/2,IL10)的 markers。K. WB檢測表達(dá)或不表達(dá)miR-503的SIM-A9細(xì)胞中p-STAT3, STAT3, p-p65 和p65。L. WB檢測加入或不加入miR-503的SIM-A9細(xì)胞和人小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（HMC-3）中PD-L1的表達(dá)。M. IHC檢測乳腺癌的顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤中PD-L1和IBA-1的表達(dá)。N. 加入或不加miR-503的SIM-A9與來自小鼠脾臟組織的祖T細(xì)胞共培養(yǎng)后，CFSE實(shí)驗(yàn)研究T細(xì)胞的增殖。

7.氟達(dá)拉濱能夠抑制低表達(dá)XIST腫瘤細(xì)胞的生長。

圖7. 氟達(dá)拉濱能夠抑制低表達(dá)XIST乳腺癌細(xì)胞的生長。

A.在正常表達(dá)或下調(diào)XIST的MCF7細(xì)胞中，通過MTS實(shí)驗(yàn)檢測FAD批準(zhǔn)的藥物庫和化學(xué)藥物庫（分別包含1250和140個(gè)化合物）。B. 用不同濃度的氟達(dá)拉濱處理MCF7-shCTRL和MCF7-shXIST細(xì)胞進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)。C. 用不同濃度的氟達(dá)拉濱處理差異表達(dá)XIST的癌癥細(xì)胞系。D. 在正常表達(dá)或下調(diào)XIST的231BrM細(xì)胞中進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)。E. 通過心臟注射，將MCF7-shXIST細(xì)胞注射到裸鼠體內(nèi)后，進(jìn)行氟達(dá)拉濱不處理或處理后，lVlS檢測腫瘤的生長。F. Kaplan–Meier分析E中顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤和生存之間的關(guān)系。G. 用氟達(dá)拉濱處理或不處理的小鼠顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤進(jìn)行HE染色。H. 在顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤中XIST的下游效應(yīng)。在癌癥細(xì)胞中下調(diào)XIST能夠促進(jìn)EMT、通過MSN上調(diào)c-Met信號(hào)通路、外泌體分泌的miR-503上調(diào)。外泌體miR-503能夠激活小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞并啟動(dòng)M1-M2的極性轉(zhuǎn)換，這能夠抑制T細(xì)胞的活性。