水凝膠——外泌體治療后肢缺血的“增強子”

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）衍生的外泌體已被認(rèn)為是各種疾病無細(xì)胞治療的新候選者。然而，保持移植后體內(nèi)外泌體隨時間的保留率和穩(wěn)定性是MSC衍生的外泌體在床應(yīng)用中的主要挑戰(zhàn)。一篇發(fā)表在《ACS Applied Materials & Interfaces》（IF=8.097）上名為《Enhanced Therapeutic Effects of MSC-derived Exosomes with an Injectable Hydrogel for Hindlimb Ischemia Treatment》的文章研究了人胎盤來源的MSCs（hP-MSCs）衍生的外泌體與殼聚糖水凝膠結(jié)合是否可以提高外泌體的保留率和穩(wěn)定性，并進(jìn)一步增強其治療效果。研究結(jié)果表明，通過Gaussia熒光素酶成像證實了殼聚糖水凝膠顯著提高了外泌體中蛋白質(zhì)和microRNA的穩(wěn)定性，并且增大了外泌體在體內(nèi)的保留率。此外，該項研究評估了水凝膠摻入的外泌體體外的內(nèi)皮保護(hù)和促血管生成能力，同時評估了水凝膠摻入的外泌體在后肢缺血小鼠模型中的治療功能。數(shù)據(jù)表明，殼聚糖水凝膠可以增強外泌體的保留率和穩(wěn)定性，并進(jìn)一步增強后肢缺血的治療效果。本研究中使用的策略可能有助于開發(fā)簡單有效的方法來評估和增強干細(xì)胞衍生的外泌體的治療效果。

技術(shù)路線

結(jié)果
1. 外泌體的表征和生物發(fā)光報告系統(tǒng)的構(gòu)建

圖1. 外泌體的特征和生物發(fā)光報告標(biāo)記。

（A）外泌體的透射電子顯微鏡（TEM）圖像。比例尺，100 nm。（B）外泌體和hP-MSC中CD9，Alix和GM130的Western雜交分析。（C）通過動態(tài)光散射測量外泌體的大小分布。（D）生物發(fā)光報告質(zhì)粒表達(dá)Gluc-乳粘素融合蛋白的示意圖。（E）隨外泌體濃度增加Gluc (Gaussia luciferase)標(biāo)記的外泌體的體外成像顯示出增強的生物發(fā)光信號（R2=0.9892）。（F）用生物發(fā)光成像（BLI）分析在不同時間點HUVEC對Gluc標(biāo)記的外泌體的內(nèi)化。

2. 熱敏性水凝膠的表征及其對外泌體的釋放

圖2. 熱敏性殼聚糖水凝膠和殼聚糖水凝膠摻入的外泌體的表征。

（A）殼聚糖溶液（I）和水凝膠（II）的光學(xué)圖像。（B）殼聚糖水凝膠的掃描電子顯微鏡（SEM）圖像。（C）通過流變學(xué)測量分析殼聚糖水凝膠隨溫度變化的流變性質(zhì)。（D）使用BLI分析Gluc信號檢測CS-Exo外泌體的持續(xù)釋放。（E）通過Gluc信號的定量分析檢測釋放的外泌體。信號強度以photons/s/cm2/steradian (sr)表示。（F）在浸入PBS 12 h內(nèi)外泌體在CS-Exo中的保留率（R2=0.8672）。（G）通過BLI圖像和Gluc信號定量評估從CS-Exo釋放的外泌體的內(nèi)化。信號強度以photons/s/cm2/steradian (sr)表示。所有實驗均在三個獨立實驗中進(jìn)行，數(shù)據(jù)顯示為平均值±SEM。

3. 殼聚糖水凝膠增強了外泌體的保留和穩(wěn)定性

圖3. 殼聚糖水凝膠增強了外泌體的穩(wěn)定性和保留率。

（A）通過BLI分析追蹤Gluc信號體內(nèi)監(jiān)測移植的CS-Exo或Exo的保留率。（B）Gluc信號的定量分析圖3A中外泌體的保留率。信號強度以photons/s/cm2/steradian (sr)表示。（C）通過real-time qPCR分析評估CS-Exo或Exo中miR-126在37℃下的穩(wěn)定性。相對基因表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為U6，并通過2-ΔΔCt方法分析數(shù)據(jù)。（D）通過Gluc信號評估CS-Exo或Exo中蛋白質(zhì)在37℃下的穩(wěn)定性。Gluc信號定量分析顯示CS-Exo中蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性優(yōu)于Exo中的蛋白質(zhì)。信號強度以photons/s/cm2/steradian (sr)表示。所有數(shù)據(jù)均代表三次獨立實驗，并表示為平均值±SEM。（n=3；*P<0.05；**P<0.01，相對于Exo）。

4. CS-Exo在體外發(fā)揮增殖和抗凋亡的作用

圖4. CS-Exo在體外發(fā)揮增殖和抗凋亡的作用。

（A）HUVEC的增殖受外泌體濃度梯度的影響。（B）在H2O2誘導(dǎo)應(yīng)激攻擊下，不同濃度的外泌體中HUVEC的存活率。（C）用100 μg/ml外泌體或CS-Exo孵育24小時的后HUVEC（GFP，綠色）增殖（Ki-67，紅色）的典型圖像。比例尺，100 μm。（D）由外泌體或CSExo進(jìn)行的HUVEC增殖指數(shù)的定量分析。（E）在H2O2誘導(dǎo)的應(yīng)激下外泌體和CS-Exo進(jìn)行的HUVEC凋亡指數(shù)的定量分析。（F）Hoechst 33342染色顯示HUVEC在暴露于400 μM H2O2后施用100 μg/ml外泌體或CS-Exo的存活率。比例尺，200 μm。所有數(shù)據(jù)均代表三次獨立實驗，并顯示為平均值±SEM。（n=3；*P<0.05；**P <0.01，相對于PBS；#P <0.05，相對于Exo）。

5. 殼聚糖水凝膠改善了外泌體促進(jìn)血管生成能力

圖5. CS-Exo改善了HUVEC的血管生成能力。

（A）用100 μg/ml外泌體或CS-Exo處理0和24小時的HUVEC的劃痕傷口愈合測定。比例尺，200 μm。（B）各組HUVEC的遷移率統(tǒng)計。（C）用100 μg/ml外泌體或CS-Exo處理12 h的HUVEC的管形成測定的典型圖像。比例尺，200 μm。（D）每組100×視野下的3個隨機區(qū)域中的節(jié)點數(shù)量的定量分析。（E）用100 μg/ml外泌體或CS-Exo處理24 h后HUVEC中的促血管生成基因的real-time qPCR分析。相關(guān)基因表達(dá)以GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化，并通過2-WWCt方法分析數(shù)據(jù)。所有實驗均在三個獨立實驗中進(jìn)行，并顯示為平均值±SEM。（n=3；*P<0.05；**P<0.01，相對于PBS；#P<0.05，相對于Exo）。

6. 摻入外泌體的殼聚糖水凝膠增加了缺血后肢的血管生成

圖6. 殼聚糖水凝膠的應(yīng)用增強了外泌體在缺血部位的促血管生成作用。

（A）在小鼠后肢缺血模型中通過BLI追蹤Vegfr2-luc表達(dá)體內(nèi)監(jiān)測CS-Exo或Exo移植后血管生成的狀態(tài)。信號強度以photons/s/cm2/steradian (sr)表示。（B）通過Fluc信號定量分析缺血后肢血管生成的動態(tài)趨勢。（C）在第14天肌肉切片CD31（紅色）染色的典型圖像。細(xì)胞核用DAPI復(fù)染。比例尺，50 μm。（D）每組中缺血肢體毛細(xì)血管密度的定量分析。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。（n=5；*P<0.05；**P<0.01，相對于PBS；#P <0.05，相對于Exo）。

7. 聚糖水凝膠摻入外泌體改善了缺血后肢的功能

圖7. CS-Exo的治療加速缺血性肌肉的恢復(fù)。

（A）每組中保肢，足部壞死和肢體損失的百分比（n=10）。（B）各組缺血后肢動態(tài)損傷和缺血性損傷的半定量臨床評估（n=10）。（C）肌肉切片第14天H&E染色和第28天Masson's trichrome染色的典型圖像（n=5）。比例尺，100 μm。（D）Masson's trichrome染色切片中纖維化面積的定量分析。（E）hP-MSC衍生的外泌體與CS水凝膠結(jié)合用于肌肉再生的示意圖。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。（*P<0.05；**P<0.01，相對于PBS；#P <0.05，相對于Exo）。