從心肌成纖維細胞中提取的外泌體mi423-3p介導缺血后處理對心臟的保護作用

  在冠狀動脈疾病中，早期的缺血再灌注以及經(jīng)皮冠狀動脈介入治療可以在一定程度上降低心肌梗死，但也會增加心肌缺血再灌注損傷（IRI）的風險。而缺血后灌注不僅可以減少IRI，也在一定程度上下調(diào)了心肌細胞凋亡。外泌體包裹的miRNA在心血管系統(tǒng)內(nèi)的細胞間通訊有重要作用，心肌成纖維細胞（CFs）是心臟中數(shù)量最多的細胞，其是否通過分泌的外泌體中的miRNA在缺血后處理中起到對心肌的保護作用還有待研究。中南大學的羅慧博士通過建立transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)，缺氧/復氧（H/R）可以促進CFs外泌體的產(chǎn)生，缺血后處理可以增強CFs外泌體對H/R細胞的保護功能。

技術(shù)路線

結(jié)果

1.心臟成纖維細胞分泌的外泌體保護H/R后H9C2細胞活性，且H/R-后處理可以增強這種保護作用。與常氧組相比，H/R后 H9C2細胞活性降低，H9C2細胞與成纖維細胞共培養(yǎng)時，細胞活性增加（圖A）；WB檢測細胞凋亡，H/R后，細胞凋亡增多，H/R后處理，細胞凋亡下降（圖B）；GW-4869處理CFs,CFs中CD63陽性囊泡積累大于對照組和DMSO處理組（圖C）；GW-4869可以明顯降低CFs的活性（圖D）；GW-4869處理后，細胞凋亡升高（圖E）；HR-后處理可以增強CFs分泌外泌體對心肌的保護作用（圖F，圖G）

2.H/R和H/R后處理，從CFs細胞釋放的外泌體可被H9C2細胞攝取。電鏡鑒定外泌體（A）;NAT鑒定外泌體（B）;WB鑒定外泌體標志蛋白檢測（C）;H/R和H/R后處理增強CFs外泌體標志蛋白的增加，H/R后處理可以進一步促進CFs分泌外泌體（D、E、F）；CFs分泌的外泌體（PKH26標記）可被H9C2細胞攝?。℉,I）

3.H/R后CFs分泌的外泌體對心肌細胞具有保護作用。將H9C2細胞用PBS、H/R CFs分泌的外泌體、H/R后處理CFs分泌的外泌體處理，再進行H/R處理。H/R后處理CFs分泌的外泌體明顯提高細胞生存率，降低細胞凋亡，其對心肌細胞的保護能力大于H/R CFs分泌的外泌體,H/R后處理可以增強體外循環(huán)中CFs外泌體對細胞的保護作用（A,B）;心肌梗死面積檢測I/R后外泌體處理可以明顯減少心肌梗死面積（C、D）；Tunel染色檢測細胞凋亡（E、F）;I/R處理后，心肌膠原組織顯著沉積，CFs外泌體可以明顯減少膠原沉積（G）。

4.H/R-CFs-exo和H/R-后處理-CFs-exo  miRNA表達譜。miRNA測序，11個差異miRNA（A）;PCR驗證差異miRNA;PCR驗證CFs中miR-423-3p表達（B）；PCR檢測CFs外泌體中miR-423-3P表達（C）；在心肌梗死區(qū)，miR-423-3p明顯下調(diào)，且I/R-后處理逆轉(zhuǎn)了這一效應(yīng)（D）; I/R-后處理增加梗死邊緣區(qū)miR-423-3p表達（E）; miR-423-3p表達在梗死區(qū)迎合梗死邊緣區(qū)表達差異（F）; miR-423-3p在各組中的含量變化（G）； miR-423-3p過表達后檢測各組miR-423-3p變化，以及各組細胞活性（H,I）;WB檢測miR-423-3p過表達后細胞凋亡變化（J）。

5.下調(diào)miR-423-3P過表達可降低I/R后對心肌的保護作用。TTC染色檢測心肌梗死面積，下調(diào)miR-423-3P過表達可以增加心梗面積（A,B）;TUNEL染色檢測細胞凋亡（C）。

6.miR-423-3P通過靶向Rap2c保護H9C2細胞面授H/R損傷。H/R可以下調(diào)miR-423-3P的表達（A）;CCK-8檢測細胞活性（B）; miR-423-3P對細胞凋亡的影響（C）;PCR驗證miR-423-3P與靶基因Rap2c的關(guān)系（D）;雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灤_定miR-423-3P與靶細胞Rap2c的關(guān)系（E）；PCR，WB檢測 Rap2c在H/R后的表達變化（F,G）;SiRap2c檢測細胞凋亡。