從心肌成纖維細(xì)胞中提取的外泌體mi423-3p介導(dǎo)缺血后處理對心臟的保護(hù)作用
在冠狀動脈疾病中，早期的缺血再灌注以及經(jīng)皮冠狀動脈介入治療可以在一定程度上降低心肌梗死，但也會增加心肌缺血再灌注損傷（IRI）的風(fēng)險。而缺血后灌注不僅可以減少IRI，也在一定程度上下調(diào)了心肌細(xì)胞凋亡。外泌體包裹的miRNA在心血管系統(tǒng)內(nèi)的細(xì)胞間通訊有重要作用，心肌成纖維細(xì)胞（CFs）是心臟中數(shù)量最多的細(xì)胞，其是否通過分泌的外泌體中的miRNA在缺血后處理中起到對心肌的保護(hù)作用還有待研究。中南大學(xué)的羅慧博士通過建立transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)，缺氧/復(fù)氧（H/R）可以促進(jìn)CFs外泌體的產(chǎn)生，缺血后處理可以增強(qiáng)CFs外泌體對H/R細(xì)胞的保護(hù)功能。
技術(shù)路線
結(jié)果
1.心臟成纖維細(xì)胞分泌的外泌體保護(hù)H/R后H9C2細(xì)胞活性，且H/R-后處理可以增強(qiáng)這種保護(hù)作用。與常氧組相比，H/R后 H9C2細(xì)胞活性降低，H9C2細(xì)胞與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)時，細(xì)胞活性增加（圖A）；WB檢測細(xì)胞凋亡，H/R后，細(xì)胞凋亡增多，H/R后處理，細(xì)胞凋亡下降（圖B）；GW-4869處理CFs,CFs中CD63陽性囊泡積累大于對照組和DMSO處理組（圖C）；GW-4869可以明顯降低CFs的活性（圖D）；GW-4869處理后，細(xì)胞凋亡升高（圖E）；HR-后處理可以增強(qiáng)CFs分泌外泌體對心肌的保護(hù)作用（圖F，圖G）
2.H/R和H/R后處理，從CFs細(xì)胞釋放的外泌體可被H9C2細(xì)胞攝取。電鏡鑒定外泌體（A）;NAT鑒定外泌體（B）;WB鑒定外泌體標(biāo)志蛋白檢測（C）;H/R和H/R后處理增強(qiáng)CFs外泌體標(biāo)志蛋白的增加，H/R后處理可以進(jìn)一步促進(jìn)CFs分泌外泌體（D、E、F）；CFs分泌的外泌體（PKH26標(biāo)記）可被H9C2細(xì)胞攝?。℉,I）
3.H/R后CFs分泌的外泌體對心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。將H9C2細(xì)胞用PBS、H/R CFs分泌的外泌體、H/R后處理CFs分泌的外泌體處理，再進(jìn)行H/R處理。H/R后處理CFs分泌的外泌體明顯提高細(xì)胞生存率，降低細(xì)胞凋亡，其對心肌細(xì)胞的保護(hù)能力大于H/R CFs分泌的外泌體,H/R后處理可以增強(qiáng)體外循環(huán)中CFs外泌體對細(xì)胞的保護(hù)作用（A,B）;心肌梗死面積檢測I/R后外泌體處理可以明顯減少心肌梗死面積（C、D）；Tunel染色檢測細(xì)胞凋亡（E、F）;I/R處理后，心肌膠原組織顯著沉積，CFs外泌體可以明顯減少膠原沉積（G）。
4.H/R-CFs-exo和H/R-后處理-CFs-exo miRNA表達(dá)譜。miRNA測序，11個差異miRNA（A）;PCR驗(yàn)證差異miRNA;PCR驗(yàn)證CFs中miR-423-3p表達(dá)（B）；PCR檢測CFs外泌體中miR-423-3P表達(dá)（C）；在心肌梗死區(qū)，miR-423-3p明顯下調(diào)，且I/R-后處理逆轉(zhuǎn)了這一效應(yīng)（D）; I/R-后處理增加梗死邊緣區(qū)miR-423-3p表達(dá)（E）; miR-423-3p表達(dá)在梗死區(qū)迎合梗死邊緣區(qū)表達(dá)差異（F）; miR-423-3p在各組中的含量變化（G）； miR-423-3p過表達(dá)后檢測各組miR-423-3p變化，以及各組細(xì)胞活性（H,I）;WB檢測miR-423-3p過表達(dá)后細(xì)胞凋亡變化（J）。
5.下調(diào)miR-423-3P過表達(dá)可降低I/R后對心肌的保護(hù)作用。TTC染色檢測心肌梗死面積，下調(diào)miR-423-3P過表達(dá)可以增加心梗面積（A,B）;TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡（C）。
6.miR-423-3P通過靶向Rap2c保護(hù)H9C2細(xì)胞面授H/R損傷。H/R可以下調(diào)miR-423-3P的表達(dá)（A）;CCK-8檢測細(xì)胞活性（B）; miR-423-3P對細(xì)胞凋亡的影響（C）;PCR驗(yàn)證miR-423-3P與靶基因Rap2c的關(guān)系（D）;雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)確定miR-423-3P與靶細(xì)胞Rap2c的關(guān)系（E）；PCR，WB檢測 Rap2c在H/R后的表達(dá)變化（F,G）;SiRap2c檢測細(xì)胞凋亡。
