環(huán)狀RNA cSMARCA5抑制肝細胞癌的生長和轉(zhuǎn)移

環(huán)狀RNA(稱為環(huán)狀RNA)是包含許多RNA物種的共價封閉單鏈轉(zhuǎn)錄本”.近年來，高通量測序和新的研究方法表明環(huán)狀RNA的表達廣泛。許多研究已經(jīng)證明環(huán)狀RNA可以作為microRNAs (miRNAs)的海綿或與蛋白結(jié)合，而環(huán)狀RNA水平的改變會導(dǎo)致基因產(chǎn)物的異常表達，從而可能導(dǎo)致癌癥生物學(xué)。環(huán)狀RNA在癌癥中的研究也如火如荼的進行中。2018年6月發(fā)表在JOURNAL OF HEPATOLOGY（IF=14.911）上的一篇名為“Circular RNA cSMARCA5 inhibits growth and metastasis in hepatocellular carcinoma. ”的研究揭示了環(huán)狀RNA cSMARCA5在肝癌的發(fā)生發(fā)展中的機制。為我們提供了一種circRNA“教科書式”的研究思路。在本研究中，通過RNA測序(RNA-seq)，比較了成對的HCC和鄰近的非癌性肝臟(ANL)組織中環(huán)狀RNA的表達。進一步研究從SMARCA5基因的外顯子15和16中提取出一個環(huán)狀RNA 7，并將其命名為cSMARCA5(hsa_circ_0001445)。cSMARCA5在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用在體外和體內(nèi)都進行了評估。由于核RNA解旋酶DHX9 (DExH-Box解旋酶9)的廣泛存在，cSMARCA5在HCC組織中的表達較低。肝癌細胞cSMARCA5下調(diào)與侵襲性特征顯著相關(guān)，是肝切除術(shù)后肝癌患者總體生存率(OS)和無復(fù)發(fā)生存率(RFS)的獨立危險因素。體內(nèi)和體外數(shù)據(jù)表明cSMARCA5抑制了肝癌細胞的增殖和遷移。在機制上，cSMARCA5可以通過海綿化miR-17-3p和miR-181b-5p促進腫瘤抑制因子TIMP3的表達。為circRNA在肝癌進展中的應(yīng)用提供了新的視角。

技術(shù)路線

結(jié)果

1.通過人類肝癌樣本中的RNA-seq分析鑒定circular RNAs

通過肝癌組織vs癌旁組織的RNA-seq總共檢測到了13,686 個差異表達的circRNAs ，去除低豐度的共有4727 個circRNAs， 4214 circRNAs 個存在于circBase數(shù)據(jù)庫 (圖 1A). 4142 個circRNAs (87.42%) 存在于 2322個基因的外顯子區(qū)(圖 1B), length of 外顯子 circRNAs 長度小于 1,000核苷酸 (圖1C)。在中國人群 (GSE14520, GPL3921)利用GEO2R 分析了2322 個基因在214 對HBV相關(guān)的人類HCC 以及ANL 組織差異表達的基因進行IPA分析. 236 差異表達的circRNAs, 108個上調(diào)128下調(diào)(圖1D). 通過qRT-PCR檢測了部分circRNAs 在40 對HCC 以及ANL組織的表達(圖1E)，與RNA-seq 結(jié)果一致。

2.cSMARCA5在肝癌中的特征

作者選擇了SMARCA5基因的外顯子15和16衍生的circRNA并命名為cSMARCA5進行進一步研究(圖2A)。原因如下:(1)cSMARCA5是RNA-seq中最豐富的差異表達環(huán)狀RNA之一，最近的一項研究也證實了它在人類肝臟中的豐富程度。(2) cSMARCA5在HCC中顯著下調(diào)（圖2B)，而pSMARCA5 (SMARCA5的pre-mRNA)、mSMARCA5 (SMARCA5的mRNA)和SMARCA5蛋白水平均上調(diào)。為了證實cSMARCA5的環(huán)狀特性，在SMMC-7721細胞中提取RNA，當(dāng)使用oligo (dT)18引物時，與隨機六聚體引物相比，cSMARCA5的相對表達明顯下調(diào)，而mSMARCA5的相對表達沒有下調(diào)(圖2C)。這一發(fā)現(xiàn)證明cSMARCA5沒有多尾。此外，cSMARCA5對RNase R耐藥，表明cSMARCA5是環(huán)狀的 (圖2D)。使用放線菌素D抑制轉(zhuǎn)錄，然后測量SMMC-7721細胞中cSMARCA5和mSMARCA5的半衰期。結(jié)果表明，cSMARCA5比mSMARCA5更穩(wěn)定(圖2E)。此外，qRT-PCR和FISH對cSMARCA5的原位雜交(FISH)顯示了cSMARCA5主要的細胞質(zhì)分布(圖2F, G)，這些結(jié)果表明cSMARCA5是一個豐富的、環(huán)狀的、穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄本，在HCC中顯著下調(diào)。

3.cSMARCA5在HCC中的表達可以通過DHX9調(diào)控

人體內(nèi)的大部分環(huán)狀RNA“都是由具有長側(cè)向內(nèi)含子的內(nèi)外顯子加工而成，通常包含反向互補序列”。為了檢測cSMARCA5是否被I14RC和I16RC促進，野生型或cSMARCA5的一系列缺失結(jié)構(gòu)(#2-4)分別克隆到pZW1載體 (圖3A)。轉(zhuǎn)染4種載體(#1-4)后I14RC和 I16RC缺失結(jié)構(gòu)(#2-4)不能過表達cSMARCA5，說明I14RC和I16RC對于cSMARCA5的產(chǎn)生是不可缺少的(圖3B)。此外，qRT-PCR進一步證實了這一結(jié)果(圖3C)。接下來作者探究了為什么cSMARCA5在HCC中顯著下調(diào)，而pSMARCA5、mSMARCA5和SMARCA5蛋白水平上調(diào)的原因。敲除DHX9 (DExH-Box ase 9)， cSMARCA5明顯上調(diào)，而pSMARCA5和mSMARCA5無明顯變化(圖3D)。它可以通過與側(cè)方反向互補序列結(jié)合并抑制這些序列的配對來抑制環(huán)狀RNA的產(chǎn)生。cSMARCA5在使用shRNA敲低DHX9時被上調(diào)，這種效果可以通過過度表達野生型DHX9轉(zhuǎn)基因而不是‘解旋酶死亡’突變體而被挽救(圖3E)，這表明調(diào)控依賴于它的解旋酶活性我們使用DHX9抗體進行RNA免疫沉淀(RIP)，觀察到I14RC和I16RC顯著富集(圖3F)且 DHX9在HCC中明顯上調(diào)(圖3G、H)， cSMARCA5的表達與DHX9在40個HCC組織中的組織化學(xué)分?jǐn)?shù)呈負相關(guān)(圖3I)。綜上所述，cSMARCA5的下調(diào)至少部分是由于HCC中DHX9的上調(diào)。

4.下調(diào)cSMARCA5表達可預(yù)測肝切除術(shù)后肝癌患者的侵襲性臨床病理特征和不良預(yù)后。

kaplan meier的生存曲線表明, 肝切除術(shù)后肝癌患者低cSMARCA5表達具有低總生存期(OS)和無復(fù)發(fā)生存(RFS) (圖4 A、B)。多變量分析表明,cSMARCA5表達水平,加上AFP,腫瘤大小、病理衛(wèi)星,封裝,是一個總生存率或者復(fù)發(fā)生存率的獨立危險因素和 (圖4 C,D)。綜上所述,這些數(shù)據(jù)表明，HCC cSMARCA5降低與生長和轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為肝切除術(shù)后肝癌患者的獨立預(yù)后標(biāo)志物。

5. 體外和體內(nèi)實驗均表明cSMARCA5抑制肝癌的生長和轉(zhuǎn)移

CCK-8測定,劃痕實驗,transwell遷移試驗顯示過表達cSMARCA5肝癌細胞的生長和遷移 (圖5 A-C)。裸鼠成瘤實驗表明cSMARCA5過表達細胞抑制腫瘤生長 (圖5D)。進一步應(yīng)用這些皮下腫瘤組織建立原位移植肝內(nèi)轉(zhuǎn)移模型，過表達cSMARCA5肝內(nèi)轉(zhuǎn)移明顯減少(圖5E)。注射裸鼠側(cè)尾靜脈，建立肺轉(zhuǎn)移模型，使用體內(nèi)成像(IVIS)系統(tǒng)，動態(tài)監(jiān)測肺轉(zhuǎn)移過程。光子通量曲線過表達cSMARCA5肺轉(zhuǎn)移明顯減少(圖5F)。8周后，解剖肺的蘇木精和伊紅(H&E)染色進一步證實cSMARCA5過表達可顯著抑制肺轉(zhuǎn)移(圖5G)。

6.cSMARCA5可以作為miR-17-3p和miR-181b-5p的海綿

在SMMC-7721和Huh7細胞中使用AGO2抗體進行RNA免疫沉淀(RIP)， cSMARCA5被AGO2抗體顯著富集(圖6A)。使用miRanda miRNA靶預(yù)測工具，發(fā)現(xiàn)65個可能與cSMARCA5結(jié)合的miRNA。通過circRIP純化了cSMARCA5相關(guān)的RNA，發(fā)現(xiàn)miR-17-3p和miR-181b-5p有特異性富集 (圖6B)，熒光素酶報告基因?qū)嶒灡砻鱩iR-17-3p和l81b-5p降低了至少40%的熒光素酶報告活性(圖6C)。突變了miR-17-3p或miR-181b-5p的靶位點 , 使用這兩種熒光素酶報告基因，將相應(yīng)的miRNA轉(zhuǎn)染到SMMC-7721細胞后，熒光素酶活性沒有明顯變化(圖6D,E)。此外，通過生物素偶聯(lián)的miR-17-3p或miR-181b-5p模擬物的pull down實驗，我們觀察到cSMARCA5與對照組相比有明顯的富集 (圖6F)。此外，F(xiàn)ISH檢測顯示cSMARCA5和這兩個miRNA共定位(圖6G)

7.cSMARCA5通過miR-17-3p/miR-181b-5p-TIMP3通路抑制HCC的生長和轉(zhuǎn)移

檢測過表達或沉默cSMARCA5后, miR-17-3p和miR-181b-5p的共同靶點TIMP3在cSMARCA5過表達時上調(diào)幅度最大，在敲除cSMARCA5時下調(diào)幅度最大(圖7A, B)。TIMP3是一種在HCC中下調(diào)的腫瘤抑制因子,可以抑制HCC的生長和轉(zhuǎn)移。外源性miR-17-3p或(和)miR-181b-5p可以顯著抑制TIMP3的表達，而過表達cSMARCA5后抑制作用減弱(圖7C)。在功能上，CCK-8檢測顯示miR-17-3p或(和)miR-181b-5p可以促進HCC細胞的生長，而過表達的cSMARCA5可以阻斷這種促進(圖7D)。Transwell遷移實驗表明，miR-17-3p或(和)miR-181b-5p可促進HCC細胞轉(zhuǎn)移，過表達的cSMARCA5可阻斷其轉(zhuǎn)移(圖7E)。此外，TIMP3的mRNA水平下調(diào)，且與cSMARCA5在HCC組織中的表達呈正相關(guān)(圖7F, G)。

原理圖