長鏈非編碼RNA對巨噬細胞膽固醇流出和動脈粥樣硬化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

核受體調(diào)節(jié)基因表達以響應(yīng)環(huán)境因素，但控制核受體細胞類型特異性的分子事件仍然知之甚少。近日，Tontonoz和他的團隊在Nature Medicine(IF=32.621) 發(fā)表題為Transcriptional regulation of macrophage cholesterol efflux and atherogenesis by a long noncoding RNA的文章，他們發(fā)現(xiàn)長非編碼RNA（lncRNA）在調(diào)節(jié)肝X受體（LXRs）的細胞類型特異性作用中的作用，甾醇激活的核受體調(diào)節(jié)參與膽固醇體內(nèi)平衡的基因的表達，并且已經(jīng)因果關(guān)系對動脈粥樣硬化的發(fā)病機制。他們將lncRNA MeXis鑒定為基因Abca1的LXR依賴性轉(zhuǎn)錄的放大器，其對于調(diào)節(jié)膽固醇流出是至關(guān)重要的。缺乏MeXis基因的小鼠以組織選擇性方式顯示減少的Abca1表達。此外，小鼠骨髓細胞中MeXis的缺失改變了Abca1基因座的染色體結(jié)構(gòu)，損害了細胞對膽固醇過載的反應(yīng)，并加速了動脈粥樣硬化的發(fā)展。機理研究表明，MeXis與轉(zhuǎn)錄共激活因子DDX17的啟動子結(jié)合相互作用并引導其結(jié)合。鑒定MeXis作為LXR依賴性基因表達的lncRNA調(diào)節(jié)劑擴展了對核受體在生理學和疾病中的細胞類型選擇性作用的機制的理解。

技術(shù)路線

主要結(jié)果

1 巨噬細胞lncRNAs的表達被調(diào)控以應(yīng)對膽固醇負荷

圖1 LXR調(diào)節(jié)非編碼RNA MeXis。

（a）頂部，來自綜合基因組學查看器（IGV）上的MeXis基因座的數(shù)據(jù)。 底部，組蛋白標記來自MeXis基因直接區(qū)域的LICR ENCODE數(shù)據(jù).（b ）ABCAI和MeXis表達Ctrl，GW3965和/或RXR配體處理的原代小鼠巨噬細胞。(c) 用Ctrl GW3965，氧化LDL或乙?；疞DL處理的原代小鼠巨噬細胞中MeXis表達的實時PCR分析。(d) 用Ctrl或GW3965處理的原代小鼠巨噬細胞中或用載體或GW3965處理的WT小鼠解剖的肝臟通過 灌胃連續(xù)三天分析MeXis和LeXis表達。(e) MeXis基因座LXR結(jié)合的ChIP-seq分析。(f) 用Ctrl或GW3965（0.5μM）處理的所示基因型小鼠的原代小鼠巨噬細胞中MeXis表達的實時PCR分析（載體處理的WT，LXRα-KO和LXRβ-KO; g 使用編碼-非編碼索引(CNCI)軟件預測顯示的lncrna的編碼潛力。

2 MeXis是LXR-responsive lncRNA，影響Abca1表達

圖2 MeXis對Abca1表達和功能的調(diào)節(jié)。

(a) 實時PCR分析GW3965和RXR配體LG26836 h處理后加siRNAs后MeXis和Abca1表達（巨噬細胞）。（b）在用載體或GW3965處理的RAW細胞中穩(wěn)定過表達對照載體（Vect）或MeXis后10天的MeXis和Abca1表達分析。（c） 在載有[3 H]膽固醇的RAW巨噬細胞中存在ApoA-I時膽固醇流出，并用?；o酶A：膽固醇O?；D(zhuǎn)移酶抑制劑和DMSO或LXR配體處理。（d） 實時熒光定量PCR檢測初代小鼠巨噬細胞MeXis和Abca1的表達，檢測小鼠心臟、腎臟、肝臟中Abca1的表達（e）免疫印跡分析,主要從WT /GW3965處理老鼠巨噬細胞ABCA1水平 (f) WT或MeXis??/巨噬細胞膽固醇和?；o酶分析。（g）在小鼠中分離的腹膜巨噬細胞中測量的膽固醇含量。 （h）從WT或MeXis - / - 小鼠分離的腹膜巨噬細胞的油紅O染色（氧化的LDL處理72小時）。（i）MeXis（Ad MeXis）的腺病毒載體轉(zhuǎn)導小鼠的總血清膽固醇（j）用Ad-GFP或Ad-MeXis轉(zhuǎn)導小鼠后6天肝臟中的基因表達（k）來自i小鼠的肝臟中ABCA1水平的左，Western印跡分析

3 MeXis 表達降低作用于Abca1表達、膽固醇流出、動脈粥樣硬化

圖3 MeXis的缺失會損害巨噬細胞Abca1的表達，加速動脈粥樣硬化。

（a）具有動脈粥樣硬化斑塊的主動脈表面積的百分比（（b）來自a。主動脈的人臉分析的代表性照片。（c）從油紅O染色的主動脈根部切片。（d）來自主動脈根部的冷凍切片的油紅O染色劑。（e）用巨噬細胞標記物CD68和H＆E染色的主動脈根的代表性組織學。（f）激光捕獲顯微切割來自MeXis - / - 小鼠的CD68陽性細胞之前（左）和之后（右）的主動脈損傷的代表性圖像。（g）實時PCR Abca1和MeXis表達

4 MeXis與DDX17相互作用，調(diào)節(jié)Abca1轉(zhuǎn)錄。

圖4 MeXis改變Abca1位點的染色體結(jié)構(gòu)。

（a）在原代小鼠巨噬細胞中Abca1基因座處的eRNA的基因表達（b）來自所示基因型的小鼠的原代巨噬細胞中Abca1 flox等位基因的表達。 （c）來自用DMSO對照或GW3965（1μM）處理3小時的WT或MeXis - / - 小鼠的原代小鼠巨噬細胞的ATAC-seq數(shù)據(jù)的基因組瀏覽器視圖。（d）ATAC-seq分析顯示在具有GW3965處理的WT或MeXis - / - 巨噬細胞中Abca1和Tlr4基因啟動子周圍的峰處的可及性。（e）WT和MeXis - / - 巨噬細胞中有或沒有GW3965處理熱圖。

圖5 確定DDX17和 MeXis相互作用。

（a）DDX17的左，RNA免疫沉淀（IP）分析。使用來自未處理（中間）或用交聯(lián)劑甲醛（右）處理的小鼠腹膜巨噬細胞的IgG對照或DDX17抗體進行免疫沉淀后，通過以下方法測定MeXis，36B4（Rplp0），親環(huán)蛋白（Ppia）和NEAT1的表達。（b）通過ChIP-qPCR分析確定來自WT或MeXis - / - 小鼠的小鼠巨噬細胞中Abca1基因座的DDX17和LXR的募集。（c）Abca1基因座上一系列ATAC-seq位點的ChIRP-qPCR分析。d）慢病毒轉(zhuǎn)導的永生化BMDM（選擇陽性細胞庫）中DDX17水平的Western blot分析。（f）MeXis（左）和Abca1（右）在所示類型的永生化BMDM中的表達。（g）來自f的永生化BMDM中ABCA1和DDX17水平的Western blot分析。

5 LXR-MeXis軸在人體功能保守。

圖6 LXR-MeXis軸在人體功能保守。

（a）MeXis基因座位上物種間的序列相似性。 （b）ABCA1（左）和TCONS00016111（右）在用DMSO（Ctrl）或GW3965（0.5μM）處理16小時的分化的THP-1單核細胞中的表達。（c）用指定的ASO（50nM）和GW3965（0.5μM）處理的分化的THP-1細胞中的ABCA1（右）和TCONS00016111（左）表達（每組n = 3）。（d）在用指定的ASO處理的THP-1細胞中存在ApoA-I時膽固醇流出，負載[3 H]膽固醇（1.0μCi/ ml），并用?；o酶A：膽固醇O?；D(zhuǎn)移酶抑制劑和（DMSO或LXR配體）處理。（e）在用編碼靶向MeXis（lenti anti）的ASO的對照慢病毒或編碼MeXis（lenti MeXix）的慢病毒（每組n = 3）處理的MeXis - / - BMDM中的Abca1基因表達。（f）用對照或MeXis慢病毒處理的THP-1細胞中的Abca1表達。（g）來自CARDIoGRAMplusC4D聯(lián)盟的TCONS-0016111變異區(qū)域協(xié)會圖和人類冠狀動脈疾病風險分析。