長鏈非編碼RNA對巨噬細(xì)胞膽固醇流出和動脈粥樣硬化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

核受體調(diào)節(jié)基因表達(dá)以響應(yīng)環(huán)境因素，但控制核受體細(xì)胞類型特異性的分子事件仍然知之甚少。近日，Tontonoz和他的團(tuán)隊(duì)在Nature Medicine(IF=32.621) 發(fā)表題為Transcriptional regulation of macrophage cholesterol efflux and atherogenesis by a long noncoding RNA的文章，他們發(fā)現(xiàn)長非編碼RNA（lncRNA）在調(diào)節(jié)肝X受體（LXRs）的細(xì)胞類型特異性作用中的作用，甾醇激活的核受體調(diào)節(jié)參與膽固醇體內(nèi)平衡的基因的表達(dá)，并且已經(jīng)因果關(guān)系對動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制。他們將lncRNA MeXis鑒定為基因Abca1的LXR依賴性轉(zhuǎn)錄的放大器，其對于調(diào)節(jié)膽固醇流出是至關(guān)重要的。缺乏MeXis基因的小鼠以組織選擇性方式顯示減少的Abca1表達(dá)。此外，小鼠骨髓細(xì)胞中MeXis的缺失改變了Abca1基因座的染色體結(jié)構(gòu)，損害了細(xì)胞對膽固醇過載的反應(yīng)，并加速了動脈粥樣硬化的發(fā)展。機(jī)理研究表明，MeXis與轉(zhuǎn)錄共激活因子DDX17的啟動子結(jié)合相互作用并引導(dǎo)其結(jié)合。鑒定MeXis作為LXR依賴性基因表達(dá)的lncRNA調(diào)節(jié)劑擴(kuò)展了對核受體在生理學(xué)和疾病中的細(xì)胞類型選擇性作用的機(jī)制的理解。

技術(shù)路線

主要結(jié)果

1 巨噬細(xì)胞lncRNAs的表達(dá)被調(diào)控以應(yīng)對膽固醇負(fù)荷

圖1 LXR調(diào)節(jié)非編碼RNA MeXis。

（a）頂部，來自綜合基因組學(xué)查看器（IGV）上的MeXis基因座的數(shù)據(jù)。 底部，組蛋白標(biāo)記來自MeXis基因直接區(qū)域的LICR ENCODE數(shù)據(jù).（b ）ABCAI和MeXis表達(dá)Ctrl，GW3965和/或RXR配體處理的原代小鼠巨噬細(xì)胞。(c) 用Ctrl GW3965，氧化LDL或乙酰化LDL處理的原代小鼠巨噬細(xì)胞中MeXis表達(dá)的實(shí)時(shí)PCR分析。(d) 用Ctrl或GW3965處理的原代小鼠巨噬細(xì)胞中或用載體或GW3965處理的WT小鼠解剖的肝臟通過 灌胃連續(xù)三天分析MeXis和LeXis表達(dá)。(e) MeXis基因座LXR結(jié)合的ChIP-seq分析。(f) 用Ctrl或GW3965（0.5μM）處理的所示基因型小鼠的原代小鼠巨噬細(xì)胞中MeXis表達(dá)的實(shí)時(shí)PCR分析（載體處理的WT，LXRα-KO和LXRβ-KO; g 使用編碼-非編碼索引(CNCI)軟件預(yù)測顯示的lncrna的編碼潛力。

2 MeXis是LXR-responsive lncRNA，影響Abca1表達(dá)

圖2 MeXis對Abca1表達(dá)和功能的調(diào)節(jié)。

(a) 實(shí)時(shí)PCR分析GW3965和RXR配體LG26836 h處理后加siRNAs后MeXis和Abca1表達(dá)（巨噬細(xì)胞）。（b）在用載體或GW3965處理的RAW細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá)對照載體（Vect）或MeXis后10天的MeXis和Abca1表達(dá)分析。（c） 在載有[3 H]膽固醇的RAW巨噬細(xì)胞中存在ApoA-I時(shí)膽固醇流出，并用酰基輔酶A：膽固醇O?；D(zhuǎn)移酶抑制劑和DMSO或LXR配體處理。（d） 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測初代小鼠巨噬細(xì)胞MeXis和Abca1的表達(dá)，檢測小鼠心臟、腎臟、肝臟中Abca1的表達(dá)（e）免疫印跡分析,主要從WT /GW3965處理老鼠巨噬細(xì)胞ABCA1水平 (f) WT或MeXis??/巨噬細(xì)胞膽固醇和?；o酶分析。（g）在小鼠中分離的腹膜巨噬細(xì)胞中測量的膽固醇含量。 （h）從WT或MeXis - / - 小鼠分離的腹膜巨噬細(xì)胞的油紅O染色（氧化的LDL處理72小時(shí)）。（i）MeXis（Ad MeXis）的腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠的總血清膽固醇（j）用Ad-GFP或Ad-MeXis轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠后6天肝臟中的基因表達(dá)（k）來自i小鼠的肝臟中ABCA1水平的左，Western印跡分析

3 MeXis 表達(dá)降低作用于Abca1表達(dá)、膽固醇流出、動脈粥樣硬化

圖3 MeXis的缺失會損害巨噬細(xì)胞Abca1的表達(dá)，加速動脈粥樣硬化。

（a）具有動脈粥樣硬化斑塊的主動脈表面積的百分比（（b）來自a。主動脈的人臉分析的代表性照片。（c）從油紅O染色的主動脈根部切片。（d）來自主動脈根部的冷凍切片的油紅O染色劑。（e）用巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD68和H＆E染色的主動脈根的代表性組織學(xué)。（f）激光捕獲顯微切割來自MeXis - / - 小鼠的CD68陽性細(xì)胞之前（左）和之后（右）的主動脈損傷的代表性圖像。（g）實(shí)時(shí)PCR Abca1和MeXis表達(dá)

4 MeXis與DDX17相互作用，調(diào)節(jié)Abca1轉(zhuǎn)錄。

圖4 MeXis改變Abca1位點(diǎn)的染色體結(jié)構(gòu)。

（a）在原代小鼠巨噬細(xì)胞中Abca1基因座處的eRNA的基因表達(dá)（b）來自所示基因型的小鼠的原代巨噬細(xì)胞中Abca1 flox等位基因的表達(dá)。 （c）來自用DMSO對照或GW3965（1μM）處理3小時(shí)的WT或MeXis - / - 小鼠的原代小鼠巨噬細(xì)胞的ATAC-seq數(shù)據(jù)的基因組瀏覽器視圖。（d）ATAC-seq分析顯示在具有GW3965處理的WT或MeXis - / - 巨噬細(xì)胞中Abca1和Tlr4基因啟動子周圍的峰處的可及性。（e）WT和MeXis - / - 巨噬細(xì)胞中有或沒有GW3965處理熱圖。

圖5 確定DDX17和 MeXis相互作用。

（a）DDX17的左，RNA免疫沉淀（IP）分析。使用來自未處理（中間）或用交聯(lián)劑甲醛（右）處理的小鼠腹膜巨噬細(xì)胞的IgG對照或DDX17抗體進(jìn)行免疫沉淀后，通過以下方法測定MeXis，36B4（Rplp0），親環(huán)蛋白（Ppia）和NEAT1的表達(dá)。（b）通過ChIP-qPCR分析確定來自WT或MeXis - / - 小鼠的小鼠巨噬細(xì)胞中Abca1基因座的DDX17和LXR的募集。（c）Abca1基因座上一系列ATAC-seq位點(diǎn)的ChIRP-qPCR分析。d）慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的永生化BMDM（選擇陽性細(xì)胞庫）中DDX17水平的Western blot分析。（f）MeXis（左）和Abca1（右）在所示類型的永生化BMDM中的表達(dá)。（g）來自f的永生化BMDM中ABCA1和DDX17水平的Western blot分析。

5 LXR-MeXis軸在人體功能保守。

圖6 LXR-MeXis軸在人體功能保守。

（a）MeXis基因座位上物種間的序列相似性。 （b）ABCA1（左）和TCONS00016111（右）在用DMSO（Ctrl）或GW3965（0.5μM）處理16小時(shí)的分化的THP-1單核細(xì)胞中的表達(dá)。（c）用指定的ASO（50nM）和GW3965（0.5μM）處理的分化的THP-1細(xì)胞中的ABCA1（右）和TCONS00016111（左）表達(dá)（每組n = 3）。（d）在用指定的ASO處理的THP-1細(xì)胞中存在ApoA-I時(shí)膽固醇流出，負(fù)載[3 H]膽固醇（1.0μCi/ ml），并用?；o酶A：膽固醇O?；D(zhuǎn)移酶抑制劑和（DMSO或LXR配體）處理。（e）在用編碼靶向MeXis（lenti anti）的ASO的對照慢病毒或編碼MeXis（lenti MeXix）的慢病毒（每組n = 3）處理的MeXis - / - BMDM中的Abca1基因表達(dá)。（f）用對照或MeXis慢病毒處理的THP-1細(xì)胞中的Abca1表達(dá)。（g）來自CARDIoGRAMplusC4D聯(lián)盟的TCONS-0016111變異區(qū)域協(xié)會圖和人類冠狀動脈疾病風(fēng)險(xiǎn)分析。