核lncRNA Charme的缺乏導(dǎo)致小鼠肌源性缺陷和心臟重塑

肌生成是一個(gè)高度調(diào)控的過程，它涉及到祖細(xì)胞轉(zhuǎn)化為多核肌細(xì)胞。除了蛋白和miRNAs之外，lncRNA已經(jīng)顯示能夠參與肌生成的調(diào)控。在2015年，Irene Bozzoni教授帶領(lǐng)他的團(tuán)隊(duì)在肌的不同分化期做了RNA-seq分析，并發(fā)現(xiàn)了新的lnRNA ，Charme，這篇文章發(fā)表在了Molecular Cell Biology（IF=5.592）雜志。鑒于此，Irene Bozzoni教授帶領(lǐng)他的團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步探究了Charme的特點(diǎn)與對(duì)肌生成的影響，并于2018年9月3日發(fā)表在EMBO（IF=10.557）雜志上。這篇文章，鑒定了Charme是一個(gè)染色體相關(guān)的lncRNA，它能夠在體內(nèi)體外促進(jìn)肌源編程。在肌細(xì)胞中，Charme敲除后能夠啟動(dòng)特異性染色體域的解體，在這其中，含有肌源性的基因會(huì)下調(diào)。特別要提的是， Charme能調(diào)節(jié)一些人心肌疾病相關(guān)的敏感基因。同時(shí)，小鼠Charme敲除后會(huì)導(dǎo)致心臟重塑表型的改變，如心臟的大小、結(jié)構(gòu)、形狀等。此外，人同源性Charme能夠調(diào)節(jié)相同靶基因簇，它的存在對(duì)Charme來說是一個(gè)重要且保守的作用。總之，這些數(shù)據(jù)描述了一個(gè)例子，新的染色體相關(guān)的lncRNA能夠調(diào)節(jié)心肌重塑。

技術(shù)路線                                   

結(jié)果
1. Charme是一個(gè)與染色體相關(guān)的lncRNA。

圖1

A. Charme的基因結(jié)構(gòu)。LNA GAPDH引物的位置： GAP-2, GAP-2/3。原位探針：綠色為內(nèi)含子，紅色為外顯子。B. sqRT-PCR檢測(cè)來自2天的去分化肌小管的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、核質(zhì)或染色體片段中的pCharme和mCharme的表達(dá)。片段的質(zhì)量用GAPDH和pre-GAPDH（前體RNAs）檢測(cè). C. MHC蛋白（綠色）和Charme RNA（紅色）在全分化的肌小管共染。D. sqRT-PCR檢測(cè)Charme在生長(zhǎng)和分化條件下的表達(dá)情況。E. qRT-PCR檢測(cè)GAP-2、GAP-2/3或GAP-scr處理的分化的肌小管中的mCharme和pCharme、MCK、MHC的表達(dá)。F. GAP-2、GAP-2/3或GAP-scr處理的C2C12細(xì)胞中MHC進(jìn)行免疫熒光染色。G. 定量GAP-2、GAP-2/3或GAP-scr處理的細(xì)胞中肌小管的形成。

2. Charme通過與nctc域相互作用調(diào)節(jié)肌形成

圖2

A.RNA-seq分析Charme敲減后，轉(zhuǎn)錄本的改變。B. Charme敲減后，對(duì)上調(diào)或下調(diào)基因的GO富集分析。C. Charme敲減后，下調(diào)基因的KEGG富集分析。D. ChRIP實(shí)驗(yàn)：富集的RNA（左圖）、富集的DNA（右圖）。E. 2天的分化肌小管中，對(duì)Charme RNA 和nctc進(jìn)行RNA/DNA FISH（左圖）或lnc-31位點(diǎn)（右圖）。（I）表示二維圖片，（II）表示三維圖片，（III）表示Z軸旋轉(zhuǎn)。黃色箭頭代表重疊信號(hào)。F. 在GAP-scr- 和GAP-2-轉(zhuǎn)染的肌小管（2天分化）中，qRT-PCR檢測(cè)Charme和Charme靶基因的表達(dá)。G. 在GAP-scr- 和GAP-2-轉(zhuǎn)染的肌小管中，ChIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RNA Pol II（左）和H3K9ac（右圖）。在GAP-scr- 和GAP-2轉(zhuǎn)染的條件下，qPCR檢測(cè)回復(fù)的染色體和基因間的表達(dá)。

3. Charme與nctc域物理性靠近

圖3

A.在肌小管生長(zhǎng)和分化（DM1）條件下，Charme和nctc（上方）的雙鏈DNA和lnc-31位點(diǎn)（下方）的FISH實(shí)驗(yàn)。B. GAP-scr- 和GAP-2-轉(zhuǎn)染的肌小管（DM1）中，Charme和nctc位點(diǎn)進(jìn)行DNA/DNA FISH實(shí)驗(yàn)。

圖4. Charme-/-小鼠的產(chǎn)生和展示的骨骼肌表型

A.上圖： Charme位點(diǎn)和sgRNA1 and sgRNA2位置示意圖；下圖：?jiǎn)捂淥DN包含的2個(gè)同源性臂（灰線）100-nt-長(zhǎng)的poly（A）/2×MAZ。B. qRT-PCR檢測(cè)來自Charme+/+ 和Charme-/-小鼠中骨骼肌勻漿中mCharme和pCharme的表達(dá)。C. 免疫熒光對(duì)來自Charme+/+ 和Charme-/-小鼠中骨骼肌組織中肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白進(jìn)行染色。D. qRT-PCR檢測(cè)來自Charme+/+ 和Charme-/-小鼠中骨骼肌中MHC和MCK轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)。E. qRT-PCR檢測(cè)來自Charme+/+ 和Charme-/-小鼠中骨骼肌中Tnnt3、Tnni2和Igf2轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)。
 

圖5. Charme-/-小鼠展示出心臟表型

A.qRT-PCR檢測(cè)來自Charme+/+ 和Charme-/-小鼠心臟勻漿中mCharme和pCharme的表達(dá)。B. 對(duì)1個(gè)月大Charme+/+小鼠（左圖）和Charme-/-小鼠（右圖）的心肌進(jìn)行蘇木精和尹紅染色。C. 免疫熒光對(duì)來自Charme+/+ 和Charme-/-小鼠中心臟組織中肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白進(jìn)行染色。D. qRT-PCR檢測(cè)來自1個(gè)月的Charme+/+ 和Charme-/-小鼠心臟勻漿中Myh7、Tnnt2和Igf2轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)。E. 1天大的Charme+/+ 和Charme-/-小鼠心臟組織中Charme和nctc位點(diǎn)的DNA/DNA FISH實(shí)驗(yàn)。

圖6.人Charme的特點(diǎn)與功能

A.帶有PCR引物（hs-2, hs-3)和LNA GAPmers (hs-GAP-int1, hs-GAP-ex2)的人Charme基因組位點(diǎn)。B. 在增殖（GM）和鑒別（3、6、10）條件下的健康和營(yíng)養(yǎng)不良（DMD）源發(fā)性肌細(xì)胞中RT-PCR檢測(cè)人hs-pCharme（上圖）和hs-mCharme（下圖）的表達(dá)。C. aqRT-PCR檢測(cè)分化的肌小管中細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中RNA片段中hs-pCharme和hs-mCharme的表達(dá)。D. PCR擴(kuò)增分析hs-pCharme內(nèi)含子1，對(duì)oligos的位置進(jìn)行了描述。E. qRT-PCR檢測(cè)用hs-GAP-int1、hs-GAP-ex2或hs-GAPscr GAPmers處理分化5天的原代細(xì)胞中hs-mCharme、hs-pCharme、MCK、MHC、Igf2、Tnnt3、Tnni2、和Dmd mRNAs水平的表達(dá)。F. pCharme行為模式圖：在增生的成肌細(xì)胞中，Charme沒有被表達(dá)，它的染色質(zhì)位點(diǎn)在空間上與nctc區(qū)域相距遙遠(yuǎn)；在分化的肌小管中，pCharme穩(wěn)定在兩個(gè)位置的物理距離允許它們共同調(diào)控的表達(dá)式。