LncRNA上游機制研究：在胃癌中EGR1介導(dǎo)lncRNA-HNF1A-AS1轉(zhuǎn)錄從而提高細胞周期進程

欄目：最新研究動態(tài) 發(fā)布時間：2018-10-09
長鏈非編碼RNAs（LncRNAs）在各種人類癌癥中都出現(xiàn)失調(diào)，并控制腫瘤的發(fā)生和進展......

長鏈非編碼RNAs（LncRNAs）在各種人類癌癥中都出現(xiàn)失調(diào)，并控制腫瘤的發(fā)生和進展。然而，LncRNAs失調(diào)的上游機制仍不清楚。這項研究證明了肝細胞核因子1同源框A反義RNA 1（HNF1A-AS1）在胃癌（GC）組織中表達顯著上調(diào)。過表達HNF1A-AS1促進細胞增殖和細胞周期進程，而敲除HNF1A-AS1得到的實驗結(jié)果則相反。早期生長反應(yīng)蛋白1（EGR1）直接結(jié)合HNF1-As1啟動子區(qū)域并激活其轉(zhuǎn)錄。過表達EGR1增強了細胞增殖并促進了細胞周期進程，與HNF1-As1的功能相似。HNF1A-AS1可作為競爭性內(nèi)源性RNA(ceRNA)與miR-661結(jié)合，上調(diào)miR-661直接靶向的細胞分裂周期蛋白34(CDC34)的表達。研究還發(fā)現(xiàn)EGR1和HNF1A-AS1可以促進細胞周期素依賴性激酶2(CDK2)、CDK4和細胞周期素E1的表達，并通過促進CDC34介導(dǎo)的p21泛素化的降解而抑制p21的表達。

綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明EGR1激活HNF1A-AS1調(diào)節(jié)各種促生長因子和抗生長因子以促進GC的發(fā)展，暗示它可能作為治療干預(yù)該病的靶點。


實驗路線：

image.png


實驗結(jié)果：

1. HNF1A-AS1促進細胞增殖和細胞周期進程

image.png

A: HNF1A-AS1在胃癌組織中高表達。B-C: HNF1A-AS1促進細胞增殖。D-G：HNF1A-AS1增加細胞代謝活性。H-I：HNF1A-AS1促進細胞非貼附性生長。J-K：HNF1A-AS1促進細胞遷移和侵襲能力。L-O：HNF1A-AS1促進腫瘤的形成。


2. HNF1A-AS1促進細胞周期進程

image.png

A: 過表達HNF1A-AS1增加S期細胞比例。B：沉默HNF1A-AS1減少S期細胞比例。C-D：過表達或沉默HNF1A-AS1細胞凋亡不發(fā)生改變。


3. EGR1直接與HNF1-As1啟動子結(jié)合

image.png

A：HNF1-As1啟動子上游2000bp序列。B：啟動子不同區(qū)域活性分析。C：啟動子結(jié)合區(qū)域活性分析。D-K: EGR1促進HNF1-As1的表達。F：HNF1-As1啟動子與EGR1結(jié)合區(qū)域引入三個點突變。G-J: EGR1直接與HNF1-As1啟動子結(jié)合。K：在人類胃癌組織中EGR1與HNF1-As1的表達正相關(guān)。


4. EGR1促進細胞增殖并加快細胞周期進程

image.png

A：EGR1促進細胞增殖。 B：EGR1增加細胞代謝活性。C：EGR1增加細胞非貼附性生長。E：EGR1促進cyclinE、CDK4、CDK2的表達，降低P21的表達。D：EGR1增加S期細胞比例。F：EGR1不影響細胞凋亡。


5. HNF1-As1促進P21的泛素化降解

image.png

A：HNF1-As1促進cyclinE、CDK4、CDK2的表達。B-C：HNF1-As1降低P21的表達。D-K: 過表達或沉默HNF1-As1不影響P21 mRNA的表達。L-M：過表達HNF1-As1降低P21的穩(wěn)定性。N-Q：過表達HNF1-As1， MG-132處理細胞后P21表達增加。 R：過表達HNF1-As1后EGR1的泛素化降解增加。S：過表達HNF1-As1小鼠癌癥組織中P21表達下降。


6. HNF1-As1通過CDC34調(diào)控P21泛素化降解

image.png

A-B：過表達CDC34導(dǎo)致P21表達下降。 C-J：過表達或沉默CDC34，P21 mRNA表達水平不發(fā)生改變。 K-N：過表達CDC34，P21的半衰期縮短。 O-P：過表達CDC34，MG-132處理細胞后內(nèi)源性P21增加。 Q：挽救實驗。沈默CDC34可以恢復(fù)由過表達HNF1-As1引起的P21蛋白的下降。


7. HNF1-As1作為ceRNA發(fā)揮作用

5bbc2604e20b2.png

A：共同靶向HNF1-As1及CDC34的miRNA。B-C：miR-661和miR-663可結(jié)合HNF1-As1。 D-E：miR-661可結(jié)合CDC34.。F：只有miR-661能夠在兩種胃癌細胞系中同時降低CDC34的表達。 G-I：miR-661抑制細胞的遷移、侵襲和增殖。 J：RIP實驗表明miR-661可以和HNF1-As1及CDC34結(jié)合。 K-L：miR-661可以富集到HNF1-As1和CDC34。M-N：過表達CDC34后HNF1-As1表達上調(diào)，沉默CDC34后HNF1-As1表達下調(diào)。


8. 作用機制圖

image.png