巨噬細胞分泌外泌體促進胰腺癌抵抗吉西他濱
吉西他濱通過終止DNA復制來抑制細胞生長的一種抗腫瘤藥物，臨床上用作晚期胰腺癌患者在氟尿嘧啶類失敗后的二線用藥，能夠改善患者的生活質量，但胰腺導管腺癌會對吉西他濱產(chǎn)生抵抗。腫瘤相關巨噬細胞最近被證明能夠促進癌細胞對吉西他濱的抵抗，但是這一過程的確切機制還不明確。
最近來自以色列Rambam醫(yī)學中心的研究人員對胰腺導管腺癌抵抗抗腫瘤藥物吉西他濱的機制進行了深入研究，并將相關研究結果發(fā)表在國際學術期刊Cancer Research上（IF=9.130）。在這項研究中，研究人員通過一個胰腺導管腺癌的基因小鼠模型和電鏡分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤相關巨噬細胞通過分泌外泌體與腫瘤微環(huán)境交流，并且這些外泌體能夠被癌細胞特異性捕獲內化。研究人員將合成的dsDNA轉入小鼠腹膜巨噬細胞中，再將細胞注射到胰腺導管腺癌荷瘤小鼠體內，發(fā)現(xiàn)原位腫瘤和肝轉移灶內的dsDNA片段濃度比正常組織中更高。
研究發(fā)現(xiàn)巨噬細胞分泌的外泌體能夠顯著降低胰腺導管腺癌細胞對吉西他濱的敏感性，無論是在體外還是體內實驗中均如此。這種效應由外泌體中microRNA-365所介導，miR-365能夠通過上調癌細胞內三磷酸核苷酸的水平，誘導胞苷脫氨酶的表達，抵抗吉西他濱的作用。研究結果也證實miR-365能夠誘導胰腺導管腺癌荷瘤小鼠抵抗吉西他濱的治療作用，而miR-365的拮抗劑則可以恢復癌細胞對吉西他濱的敏感性。研究人員還發(fā)現(xiàn)缺失Rab27 a/b的小鼠無法分泌外泌體，因此對吉西他濱的應答顯著好于野生型小鼠。
綜上所述，這些結果表明巨噬細胞分泌的外泌體是胰腺導管腺癌抵抗吉西他濱的關鍵因素，阻斷miR-365的作用可 以增強癌細胞對吉西他濱的應答。
技術路線
結果
1. mp巨噬細胞分泌外泌體和吉西他濱耐藥性檢測
圖1
A. 小鼠腹腔巨噬細胞培養(yǎng)基中外泌體的電鏡圖片。B. 外泌體的電鏡分布圖。C. WB分析來自M2極性mp巨噬細胞的外泌體。D. K989細胞、外泌體預處理和對照組與不同濃度的吉西他濱共孵育后的增殖情況。E. 不同濃度的吉西他濱處理K989細胞后的增殖情況。F. MiaPaCa-2（胰腺癌細胞系）細胞、THP-1來源的外泌體、對照組與不同濃度的吉西他濱共孵育后的增殖情況。
2. MED的篩選
圖2
A. 有或沒有染色的外泌體（綠色）的K989細胞進行confocal，細胞膜為紅色。B. 外泌體在K989細胞內的3D圖。C. 來源于質膜或核的外泌體分布情況。D. 外泌體通過K989內在化。實驗設計（上），K989細胞（細胞角蛋白陽性）或基質細胞（細胞角蛋白陰性）攝取的外泌體進行FACS分析。E. qPCR檢測PDAC細胞（CK+），巨噬細胞（F4/80+）和基質細胞（negative）。
3. 來源于巨噬細胞的外泌體能夠將miRNA-365轉運到PDAC細胞中，誘導吉西他濱耐藥
圖3
A. qPCR檢測M1和M2極性來源的外泌體的miRNAs的富集情況。B. qPCR檢測吉西他濱、吉西他濱+MDE、對照組（正常培養(yǎng)基）孵育K989細胞后的miRNA的富集。C. 在K989細胞中，不同處理后miR-365的表達變化情況。D. 不同處理后K989細胞的增殖情況。E.實驗設計流程圖。F. miR-365在K989細胞中的表達。G. FACS分析過表達miR-365的M2極化的mp巨噬細胞共孵育的K989細胞。
4. 巨噬細胞來源的外泌體和miR-365調節(jié)嘧啶的合成和CDA表達
圖4
A.MDE或對照組預處理的K989細胞加入吉西他濱后的LC-MS代謝組學的熱圖。B. 在K989細胞中轉染miR-365或NC后，孵育MDE或對照組后的LC-MS代謝組學的熱圖。C.關于a圖的信號通路富集情況。 D.LC/MS 分析加或不加MDE的K989細胞中dNTPs的濃度。E. 關于b圖的信號通路富集情況。F. LC/MS 分析轉染miR-365或NC的K989細胞中dNTPs的濃度。G. WB檢測提高NTPs濃度的K989細胞中的CDA的表達。H. qPCR檢測轉染寡核苷酸K989細胞中的CDA的表達。I. WB檢測K989細胞中的CDA的表達。J. LC/MS 分析K989細胞、加或不加MED后的排泄物中dFdUridine的表達情況。K. MS分析K989細胞的排泄物中dFdUridine的表達情況。L. 來自K989細胞和MDE孵育后的裂解液進行IP。
5. 在體內，巨噬細胞來源的外泌體和吉西他濱耐藥性
圖5
A. 實驗步驟。B. 超聲測量WT 和Rab27KO小鼠在2-7周的腫瘤體積大小。C. 病理測量WT 和Rab27KO小鼠在2-7周的腫瘤體積大小。D. WT 和Rab27KO小鼠腫瘤的巨噬細胞免疫熒光（F4/80-red）。E. WT 和Rab27KO小鼠腫瘤的CDA免疫熒光。F. F4/80 細胞/體積的定量。G. CDA在e中的熒光密度。
6. 在體內，mp巨噬細胞能夠通過攜帶miR-365加劇免疫應答
圖6
A.將K989細胞移植Rab27KO后兩周，WT和Rab27KO小鼠來源的mp巨噬細胞（轉染NC或miR-365）注射到小鼠體內。B. 在PDAC 腫瘤中進行Rab27KO和CDA免疫熒光。C. 量化b圖。D. Kaplan-Meier分析。
總結
圖7. 腫瘤相關的巨噬細胞誘導吉西他濱藥物的機制總結。
MDE能夠攜帶轉運從PDAC細胞中篩選出的miR-365。吉西他濱被轉運到PDAC中，并且被dCK磷酸化后產(chǎn)生dFdCTP或通過CDA脫去氨基到dFdU，這會分泌到細胞外。在PDAC細胞中，miR-365上調，包內NTP的濃度提高，這會競爭dFdCTP對DNA的結合能力。NTPs的提高也會上調CDA的表達，進一步促進dFdC脫氨基。