低氧腫瘤外泌體miRNA通過巨噬細胞極化促進癌轉(zhuǎn)移的機制研究

胰腺癌（PC）是一高度惡性的腫瘤，預(yù)后極差。未接受治療的胰腺癌病人的生存期約為4個月。PC患者的高死亡率主要是由于早期診斷困難、局部侵襲和早期轉(zhuǎn)移。因此，發(fā)現(xiàn)新的診斷生物標志物和更好地理解PC轉(zhuǎn)移的分子機制是至關(guān)重要的。腫瘤轉(zhuǎn)移與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)，其中缺氧和炎性細胞浸潤是導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境發(fā)生改變的重要因素。外泌體可以由多種細胞產(chǎn)生，通過傳遞其內(nèi)容物在細胞間通訊中發(fā)揮重要作用。最近有研究表明，缺氧可能通過改變外泌體的釋放來調(diào)節(jié)細胞間的溝通從而促進腫瘤的進展。來自腫瘤細胞的外泌體通過腫瘤和周圍基質(zhì)組織之間的傳遞、增殖和血管生成通路的激活、轉(zhuǎn)移前位點的啟動和免疫抑制的形成等，都有助于腫瘤的發(fā)展。2018年8月上海交通大學(xué)裴正軍課題組在Cancer Res（IF=9.13）上發(fā)表論文，探討了胰腺癌外泌體如何在低氧條件下調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)育的機制。他們發(fā)現(xiàn)胰腺癌細胞在低氧微環(huán)境中產(chǎn)生富含mir-301a-3p的外泌體，并通過HIF-1a和HIF-2a依賴性方式激活巨噬細胞形成Ｍ2亞型，促進胰腺癌細胞的遷移，侵襲和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。

技術(shù)路線：

結(jié)果：
1.缺氧促進胰腺癌細胞分泌外泌體并誘導(dǎo)巨噬細胞M2極化。

圖1

A:正常組和缺氧組胰腺癌細胞PANC1分泌的外泌體電鏡鑒定（凹陷半球形）；B、C：外泌體NAT鑒定（顆粒直徑30-150nm）；D、E：外泌體WB鑒定（外泌體標志蛋白CD9、CD81、TSG101、HSP70、ALIX、Flotillin-1）；F：免疫組化（IHC）檢測CD9在PC組織中的表達高于正常組織；G、H: PMA誘導(dǎo)后，THP-1細胞由單核細胞分化成為巨噬細胞，并檢測巨噬細胞標志物CD68表達；I： PKH67標記PANC1來源的外泌體孵育巨噬細胞，被標記的外泌體被巨噬細胞內(nèi)化；J:PBS組、PANC1-N-exo組、PANC1-H-exo組，IL-4組檢測M2和M1極化的標志物，其中IL-4組為陽性對照組，M2極化的標志物在PANC1-H-exo組明顯升高；K:WB檢測M2極化的標志物CD206和Arginase-1；L:人骨髓來源巨噬細胞（HBMDM）形態(tài)學(xué)檢測；M：流式檢測巨噬細胞標志物（CD11b）在HBMDM中的表達；N:PBS組、PANC1-N-exo組、PANC1-H-exo組檢測HBMDM標志物PANC1-H-exo組CD206和Arginase-1明顯升高；O:siHIF-1α后，、PANC1-N-exo組、PANC1-H-exo組CD206和Arginase-1的表達；p:免疫組化檢測CD163在胰腺癌中表達。

2.缺氧外泌體極化的M2巨噬細胞可以促進PC細胞的侵襲遷移以及上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。

圖2

A:體外間接共培養(yǎng)示意圖；B、C:BMPC-3細胞與巨噬細胞共孵育，經(jīng)過不同的方法處理后，檢測細胞遷移和侵襲，缺氧處理的BMPC-3細胞的外泌體與巨噬細胞共孵育可以明顯促進細胞的侵襲和遷移； D、E、F、G：缺氧的腫瘤細胞的外泌體與巨噬細胞共孵育可以明顯促進細胞的侵襲和遷移；H、I、J:缺氧PANC-1細胞分泌的外泌體與M2巨噬細胞共培養(yǎng)24h后， BMPC-3細胞丟失了細胞間連接，延長了細胞假足，變成了紡錘狀形態(tài)，此外,上皮細胞標記物(E-cadherin)表達降低，間充質(zhì)細胞標記物(N-cadherin, Vimentin, MMP7)表達升高 K、L、M::結(jié)果與H,I,J一致。

3.miR-301a在缺氧PC細胞外泌體中高度表達，并可以通過外泌體轉(zhuǎn)移到巨噬細胞中。

圖3

A、B:qRT-PCR檢測PC細胞外泌體中正常和缺氧狀態(tài)下miR-301a的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺氧后miR-301a含量升高；C、D：siRNA敲除BxPC-3和PANC-1細胞中HIF-1α, HIF-2α后，qRT-PCR檢測PC細胞外泌體中正常和缺氧狀態(tài)下miR-301a的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)siHIF-1α,si HIF-2α后，miR-301a的水平明顯降低，說明miR-301a的水平是依賴HIF-1α, HIF-2α的；E:PC患者血清中的miR-301a的水平高于正常對照組；F:生存分析顯示miR-301a高表達的患者的生存率低于miR-301a低表達的患者；J:miRNA-301a是胰腺癌患者除年齡、性別等預(yù)測存活率的獨立預(yù)測指標；H：低氧外泌體孵育的巨噬細胞表達的miR-301a高于正常外泌體和PBS組；I：用正常PC細胞上清液和PC細胞超離心（無外泌體）細胞上清液培養(yǎng)巨噬細胞48h,qRT-PCR檢測巨噬細胞中miR-301a水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此時miR-301a表達明顯降低；J:提取PC細胞外泌體中總RNA孵育巨噬細胞，此時巨噬細胞中miR-301a表達明顯升高。

4.外泌體miR-301a-3p誘導(dǎo)巨噬細胞M2極化，促進PC細胞的遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 。

圖4

A、B:敲除PANC-1細胞中miR-301a，NAT檢測外泌體顆粒大小和濃度，低氧處理后的外泌體大小并未明顯改變但miR-301a敲除后外泌體納米粒子的相對濃度明顯下降；C:WB鑒定外泌體標志蛋白,敲除組外泌體標志蛋白表達含量下降；D: qRT-PCR檢測到，miR-301a敲除的PANC-1細胞及外泌體中miR-301a表達明顯下調(diào)；E:低氧外泌體培養(yǎng)的M2型巨噬細胞的標志物的表達也明顯降低；E:轉(zhuǎn)染miR-301a mimics,M2巨噬細胞的標志物又顯著升高；G、H、I、J:轉(zhuǎn)染miR-301a mimics的巨噬細胞可以促進PC的遷移和侵襲；K、L、M: 轉(zhuǎn)染miR-301a mimics的巨噬細胞可以促進上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。

5.外泌體miR-301a通過下調(diào)PTEN表達，激活PI3Kγ信號通路誘導(dǎo)巨噬細胞M2極化。

圖5

A、B、C、：雙熒光素酶報告基因驗證靶基因PTEN：D、E:PCR，WB檢測PTEN的基因和蛋白表達情況；F、G:PC細胞外泌體與巨噬細胞共孵育,檢測PC細胞中PTEN, PI3K γ, p-AKT，AKT，p-mTORand mTOR蛋白表達水平,驗證缺氧PC細胞外泌體可以促進PI3K γ通路的激活；H、I: 缺氧PC細胞外泌體miR-301a可以促進PI3K γ通路的激活；J、K: PI3K γ敲除CD206, p-AKT，p-mTOR蛋白表達含量降低；L、M: PI3K γ敲除后，PANC-1細胞侵襲遷移減少；N、O: PI3K γ敲除后,轉(zhuǎn)染miR-310amimics后，PANC-1細胞侵襲遷移增多。

6. 外泌體miR-301a-3p通過在體內(nèi)誘導(dǎo)巨噬細胞M2極化促進PC細胞的肺轉(zhuǎn)移。

圖6

A:小鼠尾靜脈注射PC細胞的外泌體在正常調(diào)件以及缺氧后分別注入巨噬細胞或miR-301amimics轉(zhuǎn)染進PC細胞并與巨噬細胞混合后一同注射進小鼠體內(nèi)，檢測肺轉(zhuǎn)移情況；B:各組轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)；C:將巨噬細胞和PANC-1細胞注射進小鼠尾靜脈后，裸鼠的體重變化；D:缺氧外泌體miR-301a促進巨噬細胞和胰腺癌轉(zhuǎn)移的示意圖。