MiRNA 如何賣高分？--巧聯(lián)腫瘤免疫！
2018年度諾貝爾生理或醫(yī)學獎頒給了美國科學家詹姆斯·艾利森(James P。 Allison)和日本科學家本庶佑(Tasuku Honjo)。兩位科學家因發(fā)現(xiàn)“抑制負免疫調節(jié)的癌癥療法”獲此殊榮。
作為全球抗腫瘤藥物市場最閃耀的明星，以PD-1、CAR-T為代表的免疫療法近幾年風靡全球，國內研發(fā)熱情空前。此次諾貝爾生理學或醫(yī)學獎頒給了免疫療法先驅，相關研究也有望在明年基金申請上變得更加受寵。
如何將腫瘤免疫治療與當下其他熱門的研究關聯(lián)起來？
首先看下今年中標基金PD-1研究情況：
1. PD-1/PDL-1與非編碼RNA:
2. PD-1/PDL-1與自噬:
接下來介紹一篇miRNA調控腫瘤免疫微環(huán)境的文章：
“microRNA 125a Regulates MHC-I Expression on Esophageal Adenocarcinoma Cells, Associated With Suppression of Antitumor Immune Response and Poor Outcomes of Patients”18年9月份發(fā)表在Gastroenterology（IF:20）上。
該研究發(fā)現(xiàn)，在食管癌細胞系和腫瘤組織中， MIR125a-5p和MIR148a-3p水平增加可降低抗原呈遞所需的TAP2和MHC-I的水平。食管癌高表達的MHC-I分子與適應性免疫應答的標記物相關，且顯著縮短患者的總體生存時間。
該文章機制簡單：miRNA-靶向MHC-I通路上的TAP2。
樣本：兩株細胞系，51個食管癌病人包埋癌組織，及病人信息。
研究手段只涉及一些常規(guī)實驗：RNA-seq, qPCR, wb, 熒光素酶報告基因實驗，流式，細胞毒性實驗。生信分析：基因集富集分析；統(tǒng)計學：Cox回歸分析通路與OS和RFS的關系， KM生存分析。
主要研究方案：
1. 尋找差異表達MHC-I 通路的食管癌細胞系
為確定食管癌中MHC-I基因表達的潛在調控機制，首先使用兩個食管癌細胞系:OE33和OE19。之前PCR證明 OE33和OE19細胞在參與抗原呈遞機制的TAP1和TAP2表達上存在差異。
這里作者進一步驗證TAP1、TAP2和HLA-B 的RNA和蛋白質水平在OE19中較OE33中低表達(圖1 A-C)。
MHC通路激動劑IFNG處理OE19細胞后，這幾個基因表達增加（(圖1D）。使用細胞芯片證實該通路在OE19細胞中下調（圖1E）。
2. 篩選OE33和OE19細胞中差異miRNA
qPCR芯片檢測88個調控免疫的miRNA在這兩株細胞中的表達（圖2A）
對OE19細胞中上調的7個miRNA進行單個PCR，都獲得驗證（圖2B）。
而結合位點預測只發(fā)現(xiàn)MIR125a-5p和MIR148a-3p靶向MHC-I通路中的基因（圖2C），其中MIR148a-3p已被報道。
熒光素酶報告基因實驗進一步驗證MIR125a-5p靶向TAP2（圖2D、E）
3. 驗證MIR125a-5p和MIR148a-3p對靶基因的調控，導致免疫逃逸
MIR125a-5p mimics 轉染OE33細胞，qPCR和WB驗證 靶基因TAP2表達下調（圖3A、B）
流式細胞術顯示，轉染MIR125a-5p或MIR148a-3p后，MHC-I細胞表面表達下降(圖3C)
驗證MHC通路激動劑IFNG對這兩個miRNA的調控：IFNG處理后，MHC-I缺陷的OE19細胞中兩種miRNA水平顯著降低(圖3D)。解釋了圖1中，IFNG處理后TAP2等上調情況。
接下來，作者研究由MIR125a-5p和MIR148a-3p誘導的TAP2和MHC-I表達降低是否對特異性CTL識別和殺傷腫瘤細胞有功能影響。MIR125a-5預轉染降低T細胞誘導的細胞毒性(圖3E)
食管癌組織MIR125a-5p原位雜交和TAP2免疫組化驗證表達及兩者相關性（圖4）
4. MHC-I通路表達與抗腫瘤免疫應答及腫瘤復發(fā)的關系
作者使用一個整合基因表達(51個病人RNA-seq)、生存數(shù)據(jù)和通路的疾病分型管道（圖5A）。
發(fā)現(xiàn)能夠反映MHC-I介導的抗原呈遞 的通路位于前3個的免疫相關通路，且能將患者分為兩組，生存率顯著差異（圖5B）。
KM生存率分析顯示，抗原呈遞途徑的高表達與新輔助放化療后手術切除患者的不良RFS和OS相關（圖5C、D）。
將低表達和高表達上述基因的患者進行KM生存率分析，結果顯示，TAP1高表達與不良OS相關，而TAP1、TAP2和HLA-A與不良RFS相關（圖5E、F）;
利用基因集富集分析“抗原呈遞”途徑的表達，定義MHC-I“低”和“高”患者亞群 （5G），MHC-Ihigh亞群，與臨床反應抗PD-1 相關（圖5H）, 而高表達PD-L1, PD-L2, and IDO1與不良RFS相關（圖5I-K）,高表達PD-L1與不良OS相關（圖L）
5. 食管癌中腫瘤免疫微環(huán)境的IHC鑒定
最近的研究表明，結合基因表達譜和免疫組化在預處理活檢中提高了預測免疫治療反應的準確性。為在蛋白水平上分析所用食管癌樣本的腫瘤免疫微環(huán)境，作者對石蠟包埋組織進行了CD8A、PD-1、PD-L1和PD-L2的IHC分析。與RNA-seq分析結果一致，與未復發(fā)的患者相比，復發(fā)且MHC-I表達較高的患者腫瘤中CD8A、PD-1、PD-L1、PD-L2陽性細胞增多。
