Semaphorin 7A在產(chǎn)后乳腺退化和乳腺癌中促進(jìn)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的淋巴重塑

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，淋巴結(jié)是乳腺癌最常見的轉(zhuǎn)移部位，也是判斷其預(yù)后的主要因素。因此，研究乳腺癌至淋巴轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制具有重要意義。2018年9月25日，Elder AM在Cancer Res（IF=9.1）上發(fā)表了論文，該研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，SEMA7A促進(jìn)了巨噬細(xì)胞中PDPN的表達(dá)，從而導(dǎo)致整合素和PDPN依賴性運(yùn)動和對淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，促進(jìn)淋巴管生成。從而證實(shí)，SEMA7A可能協(xié)調(diào)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的淋巴管重塑，從而推動乳腺癌的轉(zhuǎn)移。

技術(shù)路線

 
實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1.乳腺巨噬細(xì)胞和LEC標(biāo)志物的表達(dá)

A: 對淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體(LYVE-1)和巨噬細(xì)胞 f4 /80進(jìn)行了雙重免疫熒光(IF)檢測，觀察到它們在乳腺退化期間表達(dá)量豐富；B.高分辨率分析和三維重建結(jié)構(gòu)顯示LYVE-1和f4 /80都有所表達(dá)；C:不同退化階段小鼠乳腺中LYVE-1和f4 /80的表達(dá)，且在第六天達(dá)到峰值；D:妊娠未滿一年的女性乳腺組織活檢中IHC染色可見巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。

圖2.巨噬細(xì)胞中podoplanin的表達(dá)推動了淋巴管的生成

A: 在退化第6天對未孕小鼠和小鼠的乳腺組織進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)分析。發(fā)現(xiàn)退化后的小鼠免疫細(xì)胞標(biāo)記物CD45、內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子（PECAM-1，或CD31）、上皮細(xì)胞粘附分子（EpCAM）和PDPN明顯增加。B: PDPN與白細(xì)胞數(shù)量增多；C:PDPN與髓細(xì)胞數(shù)量增多；D、E、F:檢測到單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；G、H：巨噬細(xì)胞在退化過程中表現(xiàn)出PDPN的增加表達(dá)；I、J：退化巨噬細(xì)胞培養(yǎng)的LECs小管面積增加。

 
圖3.Semaphorin 7A促進(jìn)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和淋巴管生成

A:在體外基質(zhì)凝膠栓接試驗(yàn)中，F(xiàn)4/80+巨噬細(xì)胞與66cl4小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞1:1混合，收集獲得的栓接物進(jìn)行F480/LYVE-1染色；B:小鼠體內(nèi)過表達(dá)SEMA7A和退化組腫瘤在未產(chǎn)宿主中的生長速度快于對照組。C：在恢復(fù)期第1天注射的載體對照細(xì)胞獲得了與轉(zhuǎn)基因細(xì)胞過表達(dá)SEMA7A相似的SEMA7A表達(dá)水平；D: 流式細(xì)胞術(shù)分析顯示SEMA7A過表達(dá)腫瘤和退化組腫瘤增加CD45+F4/80+和CD45+F4/80+PDPN+細(xì)胞。E、F: 通過IHC對腫瘤微環(huán)境中的F480+細(xì)胞和LyVE-1 +血管進(jìn)行了驗(yàn)證;G：SEMA7A 可以促使腫瘤相關(guān)細(xì)胞PDPN CD45 + F4/80 增加；H: SEMA7A增加腫瘤相關(guān)性LVD需要宿主與腫瘤之間的合作。

圖4. Semaphorin7A促進(jìn)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的淋巴擬態(tài)

A：在未產(chǎn)乳腺細(xì)胞中SEMA7A表達(dá)量低，但在退化第6天， 8-15%的上皮(EpCAM+)細(xì)胞表達(dá)SEMA7A；B: 與野生型C57BL/6小鼠相比，我們觀察到SEMA7A 敲除小鼠在退化期第6天LECs顯著降低；C、D、E、F：PDPN+白細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞減少；G: 用免疫組化法檢測LYVE-1淋巴管及F4/80巨噬細(xì)胞，觀察WT和KO小鼠乳腺消退第6天淋巴管與巨噬細(xì)胞的關(guān)系。

圖5. SimaPrurin 7A促進(jìn)巨噬細(xì)胞PDPN表達(dá)、運(yùn)動及與淋巴管的粘附

A: SEMA7A是否直接促進(jìn)巨噬細(xì)胞中PDPN的表達(dá);B、C：跨孔濾過實(shí)驗(yàn)檢測巨噬細(xì)胞的運(yùn)動以及有無純化的SEMA7A與HDLEC單層的粘附；D、E: SAMA7A與LEC巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)物促進(jìn)淋巴管生成。G：在TouWELL遷移試驗(yàn)、黏附試驗(yàn)和三維淋巴管生成試驗(yàn)中進(jìn)行。9EG7最明顯阻斷巨噬細(xì)胞的運(yùn)動，PMAB僅觀察到輕微的活動性下降。H: 在9EG7和/或pMAB的存在下，三維結(jié)構(gòu)的整體結(jié)合被顯著破壞。

圖6. 退化淋巴管促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移

A、B：原發(fā)部位復(fù)舊的第4天和第6天，LyVE-1 +血管增加。C：退化的第4天和第6天，腋窩淋巴結(jié)的微轉(zhuǎn)移數(shù)量在早期顯著增加。D: 與從未懷孕的婦女相比，最近懷孕<5年的婦女乳腺組織中正常上皮的平均SEMA7A表達(dá)增加；E: 巨噬細(xì)胞、淋巴管和SEMA7A可能有助于腫瘤細(xì)胞在產(chǎn)后婦女體內(nèi)的擴(kuò)散；F、G、H: SEMA7A通過淋巴系統(tǒng)驅(qū)動轉(zhuǎn)移，其與淋巴結(jié)（LN）陽性患者的OS降低有關(guān)。