外泌體來源的miR-130a通過靶向在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的C-MYB激活胃癌的血管生成

遷移是胃癌預(yù)后不良的重要原因。血管生成與腫瘤侵襲和遷移密切相關(guān)。癌癥來源的外泌體在腫瘤微環(huán)境的建立中起重要作用。來自天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院的巴一、應(yīng)國(guó)光團(tuán)隊(duì)在MOL THER（IF=7.008）在線發(fā)表了題為“Exosome-Derived miR-130a Activates Angiogenesis in Gastric Cancer by Targeting C-MYB in Vascular Endothelial Cells”。他們通過連續(xù)差速離心分離外泌體，并通過透射電子顯微鏡驗(yàn)證它們。用下游細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)評(píng)估人類靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)行為的變化。通過實(shí)時(shí)qPCR和蛋白質(zhì)印跡確定miRNA靶基因的RNA和蛋白質(zhì)水平。采用小鼠異種移植模型評(píng)估外來體衍生的miR-130a與體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)之間的相關(guān)性。我們證明外泌體通過在體內(nèi)和體內(nèi)靶向c-MYB將miR-130a從胃癌細(xì)胞遞送到血管細(xì)胞中以促進(jìn)血管生成和腫瘤生長(zhǎng)。包裝在癌細(xì)胞分泌的外泌體中的miR-130a可作為血管生成的驅(qū)動(dòng)因子。因此，miR-130a可能是監(jiān)測(cè)胃癌活性的潛在生物標(biāo)志物。此外，抑制這些外泌體的表達(dá)或阻斷其傳播可能是一種新的胃癌抗血管生成治療策略。

技術(shù)路線：

主要結(jié)果：

1 C-MYB表達(dá)水平與胃癌預(yù)后呈正相關(guān)，與正常的癌旁組織相比，C-MYB蛋白在胃癌組織中下調(diào)，與對(duì)照組相比，過表達(dá)c-MYB的HUVEC表現(xiàn)出降低的遷移，增殖和血管再生能力。 然而，MYB siRNA轉(zhuǎn)染組中增強(qiáng)了HUVEC的生物學(xué)能力。c-MYB是作為miR-130a的預(yù)測(cè)的直接靶標(biāo)，并且miR-130a在GC組織中上調(diào)。

圖1

（A）與c-MYB表達(dá)相關(guān)的GC的存活曲線。 p <0.001。 （B）蛋白質(zhì)印跡分析（a）GC組織中c-MYB表達(dá)（n = 8）和相應(yīng)的定量分析（b）。 （C）預(yù)測(cè)c-MYB mRNA的30UTR內(nèi)miR-130a的結(jié)合位點(diǎn)。 （D）GC組織中miR-130a水平的qRT-PCR分析（n = 2）。 ** p <0.01。

2 外泌體將miR-130a轉(zhuǎn)運(yùn)到HUVECs并抑制c-MYB表達(dá)。

圖2

（A）電子顯微鏡掃描（a）外泌體分離的7901細(xì)胞和蛋白質(zhì)印跡分析（b）外泌體富集蛋白CD63和miRNA功能的關(guān)鍵蛋白，TSG101和Alix（n = 3）。 （B）通過qRT-PCR分析（n = 3）測(cè)定從GES-1細(xì)胞和SGC 7901細(xì)胞分離的外來體中miR-130a的水平。 （C）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的示意圖。 （D）HUVEC中熒光標(biāo)記的外泌體內(nèi)化的共聚焦顯微鏡圖像。（E）分別在SGC外泌體，miR-130a敲除外泌體和NC外泌體中的miR-130a的qRT-PCR測(cè)定（n = 3）。 （F）通過qRT-PCR檢測(cè)用不同外泌體預(yù)處理的HUVEC中的miR-130a水平（n = 3）。 （G）分別用SGC外泌體，miR-130a敲除外泌體和NC外泌體處理的HUVEC中的C-MYB表達(dá)（a），以及相應(yīng)的定量分析（b）。 （H）用不同外泌體（n = 3）處理的HUVEC中c-MYB mRNA的相對(duì)水平。

3 c-MYB是miR-130a的直接靶標(biāo)。

圖3

（A）在c-MYB mRNA的3’UTR內(nèi)預(yù)測(cè)的miR-130a的結(jié)合位點(diǎn)。 （B）miR-130a直接識(shí)別c-MYB 3 ’UTR。 （C和D）qRT-PCR分析用miR-130a類似物（C）（n = 3）和抑制劑（D）（n = 3）轉(zhuǎn)染的HUVEC的相對(duì)miR-130a水平。（E）Western印跡分析（ a）用miR-130a類似物和抑制劑（n = 3）處理的HUVEC中的c-MYB表達(dá)和相應(yīng)的定量分析（b）。（F）qRT-PCR分析用miR-130a類似物和抑制劑處理的HUVEC中c-MYB mRNA水平的（n = 3）。 ** p <0.01。

4 體外證明SGC外泌體來源miR-130a具有促進(jìn)血管生成的作用。

圖4

（A）劃痕試驗(yàn)測(cè)定證明SGC外源富集的miR-130a增加HUVEC遷移（n = 3）。 （B）（A）的定量分析。 （C）驗(yàn)證SGC外泌體衍生的miR-130a通過transwell測(cè)定增強(qiáng)HUVEC的遷移能力（n = 3）。 （D）（B）（n = 3）的定量分析。 （E）EdU分析顯示SGC外泌體促進(jìn)HUVEC的增殖（n = 3）。 （F）（E）的定量（n = 3）。 （G）通過與SGC外泌體共孵育（n = 3）增強(qiáng)HUVEC中環(huán)形成的能力。 （H）（G）的定量（n = 3）。 ** p <0.01和*** p <0.001。

5 miR-130a可以直接促進(jìn)HUVECs的生物學(xué)功能。

圖5

（A）劃痕試驗(yàn)顯示miR-130a促進(jìn)HUVEC的遷移（n = 3）。 （B）（A）（n = 3）的定量分析。（C）通過transwell測(cè)定驗(yàn)證miR-130a介導(dǎo)的細(xì)胞遷移（n = 3）。 （D）（C）的定量分析（n = 3）。 （E）EdU測(cè)定證明miR-130a增強(qiáng)HUVEC的增殖（n = 3）。 （F）（E）的定量分析（n = 3）。 （G）miR-130a增加HUVEC中環(huán)形成的能力（n = 3）。 （H）定量分析（G（n = 3）。

6 體內(nèi)驗(yàn)證外泌體來源的miR-130a在血管生成和腫瘤生長(zhǎng)中的作用。

圖6

（A）流程圖（a）描繪了從腫瘤植入小鼠切除的腫瘤組織的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和形態(tài)（b）（ n = 6）。 （B-D）異種移植腫瘤直徑（B），重量（C）和體積（D）（n = 6）的定量分析。（E）C-MYB表達(dá)（a）在植入的腫瘤中（n = 6）和相應(yīng)的定量（b）。 （F）植入腫瘤中miR-130a的qRT-PCR分析（n = 6）。 （G）從腫瘤植入小鼠的血清中分離的外來體中的miR-130a的水平（n = 6）。 （H）使用CD31抗體（n = 6; CD31廣泛用于證明內(nèi)皮組織的存在和評(píng)估腫瘤血管生成）和相應(yīng)的定量（b）的石蠟包埋的腫瘤組織的免疫組織化學(xué)分析（a）。