外泌體瓦解血腦屏障在腦轉(zhuǎn)移中的作用

腦轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的重要原因之一。腦轉(zhuǎn)移過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵事件是癌細(xì)胞通過(guò)血腦屏障（BBB）的遷移。然而，通過(guò)這一自然屏障的分子機(jī)制尚不清楚。

來(lái)自日本國(guó)家癌癥中心研究所的作者發(fā)現(xiàn)，來(lái)自癌癥的細(xì)胞外囊泡(EVs)，通過(guò)蛋白質(zhì)和miRNAs 傳遞的細(xì)胞通訊介質(zhì)，觸發(fā)了血腦屏障的崩潰。尤其是，miR-181c通過(guò)調(diào)控靶基因PDPK1，通過(guò)肌動(dòng)蛋白的異常定位促進(jìn)BBB的破壞。miR-181c降解PDPK1導(dǎo)致cofilin磷酸化下調(diào)，從而激活cofilin誘導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)。此外，研究者證明全身注射腦轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞來(lái)源的EVs促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞系的腦轉(zhuǎn)移，并優(yōu)先在體內(nèi)融入大腦。這些結(jié)果表明由EVs介導(dǎo)的一種新的腦轉(zhuǎn)移機(jī)制，可觸發(fā)血腦屏障的破壞。

主要研究結(jié)果：

1.乳腺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系的建立

圖1 腦轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系及體外模型的建立。

(a) 腦轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系制備示意圖 (b)  腦轉(zhuǎn)移小鼠生物發(fā)光圖像(左)。右邊的圖像表示小鼠腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的生物發(fā)光圖像。(c)小鼠大腦皮層和中腦HE染色切片的代表性圖像。左上方和下方分別顯示正常小鼠大腦皮層和中腦，未見(jiàn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。中間上下面板分別顯示小鼠大腦皮層和中腦，癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。箭頭表示轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞。右上方和下方的面板顯示更高的放大倍數(shù)。(d)構(gòu)建BBB體外模型的示意圖猴腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)。(e)共聚焦顯微鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞，熒光顯示顯微鏡觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞。 (f)免疫熒光顯示緊密連接蛋白(Claudin-5, Occludin和ZO-1)和N-cadherin(紅色) (g) 內(nèi)皮細(xì)胞電阻(transendoelectrical resistance, TEER)來(lái)測(cè)量腦血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的形成，證明血腦屏障的完整性。

2.抑制EV分泌抑制通過(guò)血腦屏障的侵襲性

圖2 腦轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的EV被納入內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)癌細(xì)胞的BBB調(diào)控侵襲。

(a) 透射電子顯微鏡相襯技術(shù)觀察重新懸浮的EV球團(tuán)。 (b)用ImageJ測(cè)量pkh67標(biāo)記EVs的強(qiáng)度。 (c)用PKH67標(biāo)記從癌細(xì)胞中分離出來(lái)的EVs，并將其添加到上室。圖示內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。(d)在第4天和第5天從每個(gè)細(xì)胞系中分離出的EVs添加前(第4天)和后(第5天)監(jiān)測(cè)了TEER的值。從腦轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞中分離出來(lái)的EVs在體外BBB模型中孵育24小時(shí)。 (e)用NaF(分子量376.27)測(cè)定血腦屏障通透性。體外血腦屏障模型加入mda - mb -231-lu -D3H1 (D3H1)、D3H2LN、BMD2a或BMD2b細(xì)胞和N.C.的EV，24小時(shí)后加入NaF。熒光光度計(jì)測(cè)量通過(guò)血腦屏障的NaF。 (f)在體外BBB模型中加入pkh26標(biāo)記的癌細(xì)胞(2104個(gè)細(xì)胞)。孵育48小時(shí)后，清除內(nèi)皮細(xì)胞，用熒光顯微鏡計(jì)數(shù)入侵細(xì)胞。(g) D3H1、D3H2LN、BMD2a或BMD2b細(xì)胞體外血腦屏障遷移活性。繪制了相對(duì)于D3H1細(xì)胞系的遷移細(xì)胞數(shù)量。（h）為了闡明EVs對(duì)腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞外滲的貢獻(xiàn)，作者評(píng)估了體外BBB模型中，當(dāng)這些細(xì)胞系中的EV分泌 被EV分泌相關(guān)蛋白snSMase2 和RAB27B siRNAs 抑制后，BMD2a細(xì)胞的外滲。

3.腫瘤細(xì)胞來(lái)源的ev在體內(nèi)促進(jìn)腦轉(zhuǎn)移

圖3 癌源性EV促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞腦轉(zhuǎn)移。

(a)注射D3H2LN或BMD2a細(xì)胞來(lái)源EV的小鼠大腦熒光圖像。上面的圖像代表了老鼠大腦吸收的EVs。下面的圖片代表了老鼠大腦的滲透性。以D3H2LN細(xì)胞來(lái)源的EV作為對(duì)照。這個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)了兩次。(b)光子強(qiáng)度在大腦中的分布，用ImageJ分析量化。(c) D3H2LN和BMD2a細(xì)胞源EV和N.C.的生物發(fā)光圖像。上圖為小鼠全身生物發(fā)光圖像。下面的圖片是患有癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的老鼠大腦的生物發(fā)光圖像。(d)小鼠大腦皮質(zhì)(上板)HE染色的代表性圖像。箭頭表示癌細(xì)胞。下圖為抗人波形蛋白(Hu-vimentin)免疫熒光圖像。數(shù)據(jù)分別代表至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(圖d)。

4. 細(xì)胞間連接的中斷導(dǎo)致血腦屏障的崩潰

圖4腦轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的EV促進(jìn)BBB分解。

(a)加入D3H2LN、BMD2a或BMD2b細(xì)胞的EV后，緊密連接蛋白(Claudin-5、Occludin和ZO-1)(紅色)和肌動(dòng)蛋白絲(綠色)的免疫熒光共定位。（b）添加來(lái)自D3H2LN、BMD2a或BMD2b細(xì)胞的EV后，N-cadherin(紅色)和肌動(dòng)蛋白絲(綠色)的免疫熒光共定位。(c)緊密連接蛋白、N-cadherin、肌動(dòng)蛋白和GAPDH的Western blot分析。內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)陰性對(duì)照(N.C.)或EVs處理后的蛋白。這個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)了兩次。數(shù)據(jù)分別代表至少三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)(圖a,b)。

5. EV攜帶的miR-181c減少肌動(dòng)蛋白絲組織

圖5 miR-181c在腦轉(zhuǎn)移患者血清中參與血腦屏障破壞和上調(diào)。

(a)熱圖顯示miR-181c在癌源性EV中的表達(dá)水平。(b)從D3H2LN、BMD2a和BMD2b細(xì)胞中分離得到的ev中miR-181c的含量。 (c)內(nèi)皮細(xì)胞與D3H2LN、BMD2a或BMD2b細(xì)胞分離的ev孵育24 h，內(nèi)皮細(xì)胞加入ev后24 h分離RNA, qRT-PCR檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中miR-181c的表達(dá) (d)內(nèi)皮細(xì)胞加入D3H2LN、BMD2a或BMD2b細(xì)胞的ev后，對(duì)Claudin-5、Occludin、ZO-1、N-cadherin(紅色)和肌動(dòng)蛋白絲(綠色)共免疫染色。 這些蛋白定位于mir -181c轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。(e)在轉(zhuǎn)染miR-181c或?qū)φ誷iRNA前(第4天)和后(第5天)監(jiān)測(cè)TEER值。轉(zhuǎn)染的miR-181c或N.C. siRNA在體外BBB模型中孵育24小時(shí)。 (f)緊密連接蛋白、N-cadherin、肌動(dòng)蛋白和GAPDH的Western blot分析。 (g)患者血清中miR- 181c含量。

6. PDPK1調(diào)控的肌動(dòng)蛋白定位對(duì)血腦屏障具有重要意義

圖6 miR-181c調(diào)控腦內(nèi)皮細(xì)胞PDPK1的表達(dá)。

(a)芯片分析顯示轉(zhuǎn)染miR-181c后，PDPK1在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)水平。數(shù)據(jù)表示為log2值。(b)轉(zhuǎn)染miR-181c后，PDPK1 mRNA在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)水平。 (c) PDPK1和GAPDH的Western blot分析。蛋白來(lái)源于轉(zhuǎn)染miR-181c的內(nèi)皮細(xì)胞。下圖為nc . siRNA或miR-181c轉(zhuǎn)染得到的PDPK1的強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)了兩次。(d)芯片分析顯示EV處理后PDPK1在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)水平。(e)添加D3H2LN、BMD2a或BMD2b細(xì)胞的ev后，PDPK1 mRNA在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)水平 (f) PDPK1和GAPDH的Western blot分析。蛋白來(lái)自內(nèi)皮細(xì)胞，經(jīng)D3H2LN、BMD2a或BMD2b細(xì)胞的EV處理。

圖7 內(nèi)皮細(xì)胞中miR-181c, PDPK1的靶點(diǎn)|調(diào)控緊密連接蛋白N-cadherin和肌動(dòng)蛋白的定位。

(a)加入D3H2LN、BMD2a或BMD2b細(xì)胞的ev后，緊密連接蛋白(Claudin-5、Occludin和ZO-1)、N-cadherin(紅色)和肌動(dòng)蛋白絲(綠色)的共免疫熒光。規(guī)模的酒吧。(b)緊密連接蛋白、N-cadherin、肌動(dòng)蛋白和GAPDH的Western blot分析。用PDPK1 siRNA處理的內(nèi)皮細(xì)胞蛋白。 (c) 在PDPK1 siRNA轉(zhuǎn)染前(第4天)和(第5天)后監(jiān)測(cè)TEER值或陰性對(duì)照。(d) 共轉(zhuǎn)染miR-181c和PDPK1熒光素酶的記者測(cè)量熒光素酶活性。 (e) PDPK1、cofilin、phospho-cofilin (P-cofilin)和GAPDH的Western blot分析。蛋白來(lái)自D3H2LN、BMD2a或BMD2b細(xì)胞的ev處理的內(nèi)皮細(xì)胞。 (f) PDPK1、phospho-cofilin (P-cofilin)、cofilin和GAPDH的Western blot分析。