體內(nèi)定時(shí)炸彈的引線——lncRNA H19與腹主動(dòng)脈瘤

   腹主動(dòng)脈瘤（AAA）是一種腹部主動(dòng)脈異常擴(kuò)大的病變，其發(fā)病隱秘，致死率高，破裂后如不經(jīng)救治，24小時(shí)生存率小于50%，而總死亡率則高達(dá)85%～95%，宛如深藏體內(nèi)的“定時(shí)炸彈”。這枚埋在體內(nèi)的“定時(shí)炸彈”的危險(xiǎn)性使得它逐漸得到重視，許多學(xué)者將如何治療它當(dāng)做一個(gè)值得攻克的難題，尋找誘發(fā)其發(fā)展因素。                                                                        

今年4月，Dr. Yili Sun等人在雜志《Journal of Molecular and Cellular Cardiology》上發(fā)表了一篇名為“LncRNA H19 promotes vascular inflammation and abdominal aortic aneurysm formation by functioning as a competing endogenous RNA”的文章，文章介紹了LncRNA H19 如何促進(jìn)血管炎癥進(jìn)而誘導(dǎo)腹主動(dòng)脈瘤形成的，為治療AAA提供了一個(gè)新的研究方向。
背景：腹主動(dòng)脈瘤（AAA）被認(rèn)為是一種慢性血管炎癥性疾病。然而，在整個(gè)腹主動(dòng)脈瘤形成的過(guò)程中，炎癥反應(yīng)是如何被調(diào)控的尚不完全清楚。

結(jié)果：qRT-PCR檢測(cè)到H19在人類與小鼠組織樣本中的表達(dá)上調(diào)。H19和巨噬細(xì)胞標(biāo)識(shí)物MAC-2的共染色顯示H19位于血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)和浸潤(rùn)的主動(dòng)脈巨噬細(xì)胞中。H19在體內(nèi)的過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了血管炎癥并誘導(dǎo)AAA形成，其支持因素有主動(dòng)脈形態(tài)惡化，主動(dòng)脈最大直徑值、彈性蛋白降解、白細(xì)胞介素-6 (IL-6)和巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1 (MCP-1)表達(dá)以及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。 H19抑制表現(xiàn)出了相反的效果。解救實(shí)驗(yàn)表明，IL-6中和作用能顯著緩和因H19過(guò)表達(dá)誘發(fā)的主動(dòng)脈炎癥和AAA的形成。熒光素酶報(bào)告分析和體外實(shí)驗(yàn)利用VSMCs和巨噬細(xì)胞證明，H19與let-7a microRNA內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)誘導(dǎo)其靶基因IL-6的轉(zhuǎn)錄，在一定程度上誘導(dǎo)動(dòng)脈瘤形成。這個(gè)機(jī)制通過(guò)利用不能與let-7a有效結(jié)合的突變體H19的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

結(jié)論：本研究揭示了AAA形成過(guò)程中一條致病性H19/let-7a/IL-6炎癥通路，并為AAA的治療提供了一種潛在的新策略。
研究結(jié)果：

Figure 1.H19在人類主動(dòng)脈瘤樣品和Ang II-、CaC12-誘導(dǎo)的小鼠主動(dòng)脈中再表達(dá)

A到C，人主動(dòng)脈IL-6（A），MCP-1（B）和H19（C）表達(dá)水平的qPCR結(jié)果（n=5）。連續(xù)28天給雄性ApoE-/-小鼠灌注Ang II (1μg/kg/min)或等量生理鹽水。D，小鼠主動(dòng)脈H19表達(dá)的qRT-PCR分析（n=5）。E，在主動(dòng)脈連續(xù)樣本片段中，H19的原位雜交復(fù)合染色和巨噬細(xì)胞的免疫熒光染色(MAC-2)（n=5）。雄性C57BL/6J小鼠腎主動(dòng)脈上用CaCl2紗布或生理鹽水紗布處理15分鐘。3周后進(jìn)行檢測(cè)。F，小鼠主動(dòng)脈H19水平的qRT-PCR結(jié)果（n=5）。G，H19的原位雜交復(fù)合染色和巨噬細(xì)胞的免疫熒光染色(MAC-2) (n=5)。數(shù)據(jù)以三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD表示，**P<0.01.

Figure 2.在Ang II-治療的 ApoE-/- 小鼠中，H19的減少阻止了AAA的形成
用Scr-RNA或Sh-H19轉(zhuǎn)染雄性ApoE-/-小鼠（每組25只）。三十天后，再連續(xù)28天注入Ang II。生理鹽水，連續(xù)28天給雄性ApoE-/-小鼠灌胃與生理鹽水等量的假生理水（每組10例）。A，主動(dòng)脈宏觀特征的代表圖像。B，主動(dòng)脈的二維超聲和彩色多普勒成像。C，AAA發(fā)生率的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（每組25例）。D，腹主動(dòng)脈最大直徑（每組16例）。E，主動(dòng)脈中代表性的彈性蛋白染色和彈性蛋白降解評(píng)分。照片顯示了彈性蛋白降解最嚴(yán)重的位置(每組n=15；比例尺:上200μm下50μm；放大的照片)。F，主動(dòng)脈MAC-2免疫熒光染色具有代表性(每組4例；比例尺：上200μm下50μm；放大的照片)。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD或中位數(shù)和IQR(彈性蛋白降解評(píng)分)。 *P<0.05, **P<0.01

Figure 3.在Ang II治療的C57BL/6J小鼠中H19過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)AAA形成

雄性C57BL/6J小鼠分別轉(zhuǎn)染AAV-GFP或AAV-GFP- h19(每組25只)。30天后，再連續(xù)28天注入Ang II。生理鹽水，連續(xù)28天給雄性C57BL/6J小鼠灌胃與生理鹽水等量的假生理水（每組10例）。A，主動(dòng)脈宏觀特征的代表性圖像。B，主動(dòng)脈二維超聲及彩色多普勒成像。 C，小鼠AAA發(fā)病率的統(tǒng)計(jì)分析（每組N=25）。D，腹主動(dòng)脈最大直徑(每組16個(gè))。E，主動(dòng)脈彈性蛋白染色及彈性蛋白降解評(píng)分具有代表性(每組n=15)。照片顯示的位置發(fā)生最嚴(yán)重的彈性蛋白降解(比例尺：上200μm下50μm；放大的照片)。F，主動(dòng)脈MAC-2蛋白表達(dá)的代表性免疫熒光染色及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(n=4;比例尺：上200μm下50μm；放大的照片)。 數(shù)據(jù)表示為平均值±SD或中位數(shù)和IQR(彈性蛋白降解評(píng)分)。*P<0.05，**P<0.01。

Figure 4. H19過(guò)表達(dá)促進(jìn)CaCl2-治療的C57BL/6J小鼠體內(nèi)AAA的形成

雄性C57BL/6J小鼠在用CaCl2紗布處理腎上主動(dòng)脈前30天，分別注射病毒載體AAV-GFP- h19或AAV-GFP（每組n=25)。生理鹽水，用等量生理鹽水處理假生理鹽水注射的雄性C57BL/6J小鼠（n=10）。CaCl2治療3周后進(jìn)行檢測(cè)。A，AAA的代表性圖片。B，腹主動(dòng)脈的最大動(dòng)脈直徑（每組n=10）。 C，病毒注射后主動(dòng)脈H19 RNA水平的統(tǒng)計(jì)分析（每組n=4）。 D，小鼠主動(dòng)脈彈性蛋白染色及降解評(píng)分具有代表性。照片顯示了彈性蛋白降解最嚴(yán)重的地方（每組n=10；比例尺：上 200 μm，下50 μm; 放大的圖片）。E，主動(dòng)脈MAC-2蛋白表達(dá)的代表性免疫熒光染色及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（每組n=4，比例尺：上200 μm，下50 μm；放大的圖片）。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD或中位數(shù)和IQR(彈性蛋白降解評(píng)分)。**P<0.01。

Figure 5. H19在VSMCs中起著let-7a海綿的作用
A，H19與let-7a、IL-6與let-7a之間的潛在結(jié)合位點(diǎn)以及構(gòu)建的突變體結(jié)合位點(diǎn)。B，熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果。用功能性let-7a mimics或無(wú)效let-7a 類似物 (mimicNC)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染VSMCs。24h后，用含有野生型IL-6 (IL-6- WT)或突變型IL-6 (IL-6- MUT)的熒光素酶報(bào)告轉(zhuǎn)染。24h后檢測(cè)熒光素酶活性。 C，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果。用功能性let-7a模擬物(let-7a mimics)或無(wú)效的let-7a模擬物(mimicNC) 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染VSMCs，然后用含有野生型(H19- WT)或突變體H19 (H19- MUT1, H19-MUT2)的熒光素酶報(bào)告轉(zhuǎn)染。24h后檢測(cè)熒光素酶活性。D，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果。 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染功能質(zhì)粒介導(dǎo)的H19轉(zhuǎn)錄本(pcDNA3.1-H19)或假轉(zhuǎn)錄本(pcDNA3.1-NC)，選擇性加入功能let-7a模擬物。之后，用含有野生型IL-6 (IL-6- WT)或突變型IL-6 (IL-6- MUT)的熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞。24h后檢測(cè)熒光素酶活性。**P<0.01。實(shí)驗(yàn)四重復(fù)。

Figure 6.主動(dòng)脈H19靶向并負(fù)向調(diào)節(jié)let-7a促進(jìn)IL-6在VSMCs的表達(dá)

Figure 7．較高的let-7a生物活性可延緩Ang II-治療的C57BL/6J小鼠體內(nèi)AAA的形成

雄性C57BL/6J小鼠轉(zhuǎn)染AAV-H19或AAV-H19-mut(每組n=26)。30天后，他們又被注入Ang II，持續(xù)28天。A，主動(dòng)脈宏觀特征的代表性圖像。B，腹主動(dòng)脈最大直徑(每組n=14)。C，AAA發(fā)生率統(tǒng)計(jì)分析(每組n=26)。D and E，主動(dòng)脈中代表性彈性蛋白染色(D)和彈性降解分?jǐn)?shù)(E)。照片顯示了彈性蛋白降解最嚴(yán)重的地方（每組n=14；比例尺：上200 μm，下50 μm；放大的照片)。 F and G，主動(dòng)脈MAC-2代表性免疫熒光染色(F)及其統(tǒng)計(jì)分析(G)（每組n=4；比例尺：上200 μm，下50 μm；放大的照片）。 H，血漿IL-6濃度(每組n=8)。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD或中位數(shù)和IQR(彈性蛋白降解評(píng)分)。*P<0.05， **P<0.01。

Figure 8. 證實(shí)IL-6在h19促進(jìn)AAA形成過(guò)程中的炎癥中介作用

用AAV-H19轉(zhuǎn)染雄性C57BL/6J小鼠。30天后，隨機(jī)給予托珠單抗(TCZ，一種針對(duì)IL-6受體的單克隆抗體)或等量的IgG(每組n=30)治療。治療24小時(shí)后，所有小鼠再灌注Ang II 28天，然后處死進(jìn)行檢查。A，兩組宏觀主動(dòng)脈代表圖像。B，腹主動(dòng)脈最大直徑(每組n=14)。C, AAA發(fā)生率統(tǒng)計(jì)分析(每組n=30)。D和E，主動(dòng)脈中代表性彈性蛋白染色（D）和彈性降解分?jǐn)?shù)（E）。照片顯示了彈性蛋白降解最嚴(yán)重的地方（每組n=14；比例尺：上200 μm，下50 μm；放大的照片）。F和G，主動(dòng)脈MAC-2代表性免疫熒光染色(F)及其統(tǒng)計(jì)分析(G)（每組n= 5；比例尺：上200 μm，下50 μm；放大的照片）。 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。*P<0.05，**P<0.01。