lncRNA與癌癥發(fā)展聯(lián)系大揭秘——UCA1與胃癌

  lncRNA在多種細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，近年來(lái)，關(guān)于lncRNA的研究已逐漸成為一個(gè)熱門(mén)項(xiàng)目。UCA1是一種已被發(fā)現(xiàn)的lncRNA，研究者們發(fā)現(xiàn)它多種癌細(xì)胞的遷移、侵襲和耐藥密不可分。今年7月，Dr. Wang CJ等人在雜志《molecular cancer》上發(fā)表了一篇題為“The lncRNA UCA1 promotes proliferation, migration, immune escape and inhibits apoptosis in gastric cancer by sponging anti-tumor miRNAs”的文章，探究了長(zhǎng)鏈非編碼RNA UCA1在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所扮演的角色，揭露了UCA1促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、免疫逃逸的機(jī)制，為治療胃癌提供了新的思路

摘要：

背景：UCA1是一類(lèi)長(zhǎng)鏈非編碼RNA，在胃癌（GC）等多種人類(lèi)腫瘤中均被發(fā)現(xiàn)存在過(guò)表達(dá)現(xiàn)象。目前認(rèn)為UCA1能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，但UCA1在整個(gè)免疫逃逸過(guò)程中的作用尚不清楚。

方法：我們收集了40對(duì)胃癌和非腫瘤組織樣本。采用原位雜交和qRT-PCR法測(cè)定 UCA1在胃癌和對(duì)照組織中的表達(dá)水平。采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活力。使用transwell法檢測(cè)GC細(xì)胞的遷移能力。為了了解UCA1在免疫逃逸過(guò)程中的作用，野生型或UCA1 KO GC細(xì)胞與外周血單核細(xì)胞或細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞在體外共培養(yǎng)。用小鼠模型檢測(cè)UCA1在體內(nèi)的功能。

結(jié)果：UCA1促進(jìn)GC細(xì)胞增殖和遷移，并抑制細(xì)胞凋亡。UCA1通過(guò)直接作用抑制miR-26a/b，miR-193a和miR-214的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)PDL1的表達(dá)。當(dāng)與外周血單核細(xì)胞（PBMCs）共培養(yǎng)時(shí)，UCA1-KO GC細(xì)胞可以誘導(dǎo)更高的IFNγ表達(dá)，當(dāng)在體外與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK）共培養(yǎng)時(shí)存活率較低。UCA1-KO GC細(xì)胞形成較小的腫瘤，miR-26a、- 26b、- 193a和- 214水平較高，異種移植小鼠模型細(xì)胞增殖減少，凋亡增加。

結(jié)論：UCA1過(guò)表達(dá)保護(hù)PDL1表達(dá)不受miRNAs的抑制，促進(jìn)GC細(xì)胞的免疫逃逸。UCA1可作為一種潛在的新型GC治療靶點(diǎn)。UCA1(尿路上皮癌相關(guān)1)是一種最早在人類(lèi)膀胱癌中被發(fā)現(xiàn)的lncRNA，在許多其他癌癥中發(fā)現(xiàn)其表達(dá)上調(diào)，參與癌細(xì)胞的遷移、侵襲和耐藥。

技術(shù)路線：

  研究者的實(shí)驗(yàn)思路大致如下：

結(jié)果：

一、GC患者體內(nèi)UCA1升高，且與腸型GC患者預(yù)后不良有關(guān)

  研究者首先利用兩個(gè)已發(fā)表的芯片GSE54129（111例胃癌患者和21例對(duì)照組）和GSE65801（32對(duì)胃癌和非癌組織）分析了UCA1在胃癌組織和非癌對(duì)照組織中的表達(dá)。然后收集了40對(duì)胃癌和非癌組織樣本（21例腸型，13例彌漫型，7例混合型），用qRTPCR檢測(cè)UCA1水平。為進(jìn)一步證實(shí)UCA1在GC組織中的上調(diào)并確定其亞細(xì)胞位置，研究者使用原位雜交（ISH）檢測(cè)UCA1在 GC和對(duì)照組織切片中的表達(dá)。最后，研究者分析Dr. Szász AM等人報(bào)道的數(shù)據(jù)（320例腸型GC, 241例彌漫型GC, 32例混合型GC），發(fā)現(xiàn)UCA1水平較高的腸型GC患者總體生存率較低，這說(shuō)明UCA1在胃癌發(fā)生過(guò)程中具有潛在的致癌作用。

Fig. 1 在GC組織中發(fā)現(xiàn)UCA1調(diào)解異常，與預(yù)后不良有關(guān)。a 用T檢驗(yàn)對(duì)兩個(gè)芯片（GSE54129和GSE65801）的UCA1水平進(jìn)行分析。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 B采用qPCR法檢測(cè)40對(duì)胃腺癌及相應(yīng)的鄰近非腫瘤性胃組織的UCA1水平。結(jié)果按照Lauren分類(lèi)顯示，采用單因素方差分析法分析。**p < 0.01。 c 具有代表性的原位雜交圖像顯示UCA1在GC和對(duì)照組織中的表達(dá)。用圖像J量化UCA1信號(hào)的相對(duì)密度，用T檢驗(yàn)確定其顯著性。比例尺，100 μM。 d 采用Kaplan-Meier分析320例腸型GC、241例彌漫型GC和32例混合型GC的生存數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，p < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

二、UCA1是一類(lèi)促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移并抑制凋亡的致癌基因

  為探討UCA1在GC細(xì)胞中的生物學(xué)功能，研究者構(gòu)建了UCA1過(guò)表達(dá)載體，建立了UCA1過(guò)表達(dá)GC細(xì)胞系。同時(shí)構(gòu)建UCA1敲除載體，該載體表達(dá)兩個(gè)針對(duì)UCA1啟動(dòng)子區(qū)域的向?qū)NA，構(gòu)建UCA1敲除細(xì)胞系。

  研究者利用MTT檢測(cè)細(xì)胞的存活率，用流失細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，由利用transwell檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。

Fig. 2 UCA1是一種onco-lncRNA，能夠促進(jìn)GC細(xì)胞的增殖、遷移并抑制細(xì)胞凋亡。a成功建立UCA1過(guò)表達(dá)GC細(xì)胞。b 采用MTT法測(cè)定UCA1過(guò)表達(dá)細(xì)胞和對(duì)照組GC細(xì)胞的存活率。c 原理圖為UCA1敲除載體設(shè)計(jì)。以UCA1啟動(dòng)子區(qū)為靶點(diǎn)的兩個(gè)向?qū)NA通過(guò)一個(gè)質(zhì)粒共表達(dá)。d 通過(guò)共轉(zhuǎn)染UCA1-KD載體和Cas9表達(dá)載體，成功降低了兩種GC細(xì)胞的UCA1水平。e MTT法測(cè)定UCA1-KD GC細(xì)胞的存活率。f 細(xì)胞凋亡檢測(cè)。用FITC標(biāo)記的Annexin V抗體孵育UCA1-KD或?qū)φ誈C細(xì)胞，然后PI染色。流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率。g和h細(xì)胞過(guò)夜，消耗血清，用絲裂霉素處理，然后進(jìn)入Transwell的上腔室。用4%多聚甲醛固定遷移到下腔室的細(xì)胞，然后用結(jié)晶紫染色。使用倒置顯微鏡，在5個(gè)隨機(jī)不同視野中對(duì)結(jié)晶紫染色細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，p < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 *p < 0.05， **p < 0.01
三、UCA1與miR-26a/b相互作用，調(diào)控EZH2和CDK6的表達(dá)。
  近年來(lái)的許多報(bào)道指出，lncRNA可以對(duì)各種miRNA產(chǎn)生“海綿樣”作用，從而抑制由miRNA介導(dǎo)的功能。研究者分析發(fā)現(xiàn)miR-26a和-b可以直接與UCA1結(jié)合并用雙熒光素酶驗(yàn)證，除了檢測(cè)UCA1在GC細(xì)胞中過(guò)表達(dá)時(shí)，內(nèi)源性miR-26a和-b的表達(dá)水平變化外，研究者還檢測(cè)了miR-26靶蛋白EZH2和CDK6的蛋白水平，隨后，研究者用qRT-PCR測(cè)定體內(nèi)miR-26a和-b水平。結(jié)果證明，UCA1通過(guò)海綿作用吸附miR-26a/b以調(diào)控EZH2和CDK6的表達(dá)。

Fig. 3 UCA1海綿作用吸附miR-26a/b，從而促進(jìn)miR-26a/b靶基因的表達(dá)。a 預(yù)測(cè)miR-26a/b與UCA1之間的相互作用。 b 雙熒光素酶檢測(cè)。用UCA1 3'UTR報(bào)告載體和miR-26a/b模擬物或抑制劑轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。相互作用48小時(shí)后檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性。c和d 過(guò)表達(dá)UCA1的GC細(xì)胞中miR-26a和-b水平受到抑制，miR-26a和-b靶基因表達(dá)上調(diào)。 e 采用qRTPCR法檢測(cè)40對(duì)胃癌及相鄰非腫瘤對(duì)照標(biāo)本中miR-26a和-b的水平。通過(guò)相關(guān)分析，分析UCA1與miR-26a或-b的相關(guān)性。

四、UCA1直接與miR-214和miR-193a相互作用

  研究者發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)miR-214和-193有被UCA1“海綿”吸附的潛力，此前有報(bào)道稱(chēng)此二者均具有抑制腫瘤的功能。研究者采用雙熒光素酶法測(cè)定miRNA與UCA1的相互作用。

  PDL1可以與PD-1相互作用，抑制T細(xì)胞活化，誘導(dǎo)效應(yīng)T細(xì)胞凋亡，最終削弱抗腫瘤免疫。研究者通過(guò)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)在PDL1 Mrna的3’UTR上存在miR-214和-193a靶點(diǎn)。隨后研究者采用雙熒光素酶法測(cè)定miRNA與PDL1的相互作用。

Fig. 4 UCA1與miR-193a和miR-214相互作用，然后調(diào)節(jié)PDL1的表達(dá)。a 預(yù)測(cè)UCA1與miR-193a或miR-214之間的相互作用。b 雙熒光素酶檢測(cè)。用UCA1全序列作為螢火蟲(chóng)熒光素酶3'UTR的報(bào)告載體，與HEK293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染，并加入miRNA模擬物或抑制劑。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后檢測(cè)熒光素酶活性。 c qRT-PCR檢測(cè)miR-193a和- 214的相對(duì)表達(dá)。d 預(yù)測(cè)PDL1與miR-193a或miR-214之間的相互作用。e 雙熒光素酶檢測(cè)。將HEK293T細(xì)胞與PDL1 3'UTR報(bào)告載體和miR-193a或miR-214的模擬物或抑制劑共轉(zhuǎn)染48h。檢測(cè)熒光素酶活性，用t檢驗(yàn)分析結(jié)果。 f miR-193a和miR-214抑制內(nèi)源性PDL1表達(dá)

五、UCA1通過(guò)海綿miR- 214和miR-193a調(diào)控PDL1表達(dá)

  研究者通過(guò)western blot和流式細(xì)胞術(shù)分析了UCA1敲除后GC細(xì)胞中PDL1表達(dá)，以確定UCA1敲除是否可以通過(guò)海綿miRNA誘導(dǎo)GC細(xì)胞中PDL1下調(diào)進(jìn)而減輕T細(xì)胞的抑制，同時(shí)使用拮抗劑進(jìn)行挽救，以驗(yàn)證結(jié)論。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，細(xì)胞表面PDL1水平受UCA1-miR-193a/214軸調(diào)控。

  研究者通過(guò)檢測(cè)釋放到上清液中的IFNγ水平評(píng)估如果調(diào)控GC細(xì)胞株上PDL1的表達(dá)是否可以改變受PHA刺激的健康供體PBMC的活化。

  研究者還分析了在效應(yīng)靶比為10:1至40:1的范圍內(nèi)，CIK細(xì)胞對(duì)AGS和SGC-7901細(xì)胞的細(xì)胞毒性。

Fig. 5 敲除UCA1可恢復(fù)受PHA刺激的T細(xì)胞活化，提高CIK治療的細(xì)胞毒性。a UCA1-KD GC細(xì)胞中總PDL1水平降低。b 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面PDL1。c PHA誘導(dǎo)的PBMCs與UCA1-KD或?qū)φ战MGC細(xì)胞共培養(yǎng)。ELISA檢測(cè)上清液中產(chǎn)生的IFNγ。d 降低GC細(xì)胞中PDL1的表達(dá)可以提高對(duì)體外CIK治療的細(xì)胞毒性敏感性

六、UCA1調(diào)控PDL1表達(dá)，調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫反應(yīng)

  為了探討UCA1敲除在體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)調(diào)控中的作用，研究者利用AGS細(xì)胞皮下異種移植小鼠模型檢測(cè)UCA1的功能。將AGS-NC和AGSUCA1-KO細(xì)胞皮下注射到SCID小鼠體內(nèi)。每7天測(cè)一次腫瘤體積，連續(xù)28天。

Fig. 6 UCA1表達(dá)的下調(diào)抑制了異種移植小鼠模型腫瘤的生長(zhǎng)。a 我們利用AGS細(xì)胞株研究了UCA1下調(diào)對(duì)胃癌皮下移植小鼠模型調(diào)控的影響。將AGS-NC和AGS-UCA1-KD細(xì)胞皮下注射到SCID小鼠體內(nèi)。每周測(cè)量腫瘤體積，連續(xù)4周。b 統(tǒng)計(jì)分析顯示， PDL1表達(dá)下調(diào)顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。c 28天后，UCA1-KD組腫瘤重量較對(duì)照組輕(p < 0.001)。d qRT-PCR結(jié)果顯示，UCA1-KD組miR-26a、miR-26b、miR-193a、miR-214水平升高。e 免疫組化結(jié)果顯示，UCA1-KD組的PDL1蛋白水平和Ki-67表達(dá)均下降。f 免疫印跡結(jié)果顯示，UCA1-KD腫瘤中裂解的PARP1和caspase-3表達(dá)水平升高

結(jié)論：

  UCA1可以通過(guò)抑制miR-26a和miR-26a等抗腫瘤miRNA的表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖遷移，并抑制細(xì)胞凋亡；抑制miR-193a和miR-214等miRNA的表達(dá)，使PDL1表達(dá)上調(diào)，從而抑制宿主免疫系統(tǒng)的功能。UCA1-KO GC細(xì)胞在體內(nèi)形成較小的腫瘤，miR-26a、- 26b、- 193a、- 214水平較高，細(xì)胞增殖減少，凋亡增加。

  這些研究證明，UCA1與GC的發(fā)生發(fā)展關(guān)系甚密，可以以其為新的切入點(diǎn)， 探究GC治療的新靶點(diǎn)。