開采lncRNAs巨大寶藏的神兵利器--CRISPR-Cas9 Screen

近期，癌癥研究頂級(jí)期刊Cancer Cell發(fā)表了來(lái)自瑞士伯尼爾大學(xué)的Rory Johnson教授的綜述：通過(guò)CRISPR-Cas技術(shù)篩選具有治療潛力的的長(zhǎng)鏈非編碼RNA。該文總結(jié)了新發(fā)表使用CRISPR的技術(shù)篩選與腫瘤細(xì)胞增殖和抗藥性相關(guān)lncRNAs的研究論文；并著重介紹了這一高通量、高特異性篩選方法的策略、材料和方法。小編在這和大家一起分享。

  LncRNAs（long non-coding RNAs，長(zhǎng)鏈非編碼RNA）是一類長(zhǎng)度在200 nt以上，不編碼蛋白質(zhì)的一類RNA。它們參與眾多的生物學(xué)過(guò)程，也是目前癌癥研究中的熱門內(nèi)容。其數(shù)量遠(yuǎn)超過(guò)蛋白編碼基因，達(dá)到50000甚至更多。高通量測(cè)序方法為我們發(fā)掘新的lncRNAs提供了極大的支持。通過(guò)基因測(cè)序檢測(cè)突變或全轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)表達(dá)量變化，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多癌癥相關(guān)的lncRNA。如NETA1在多數(shù)實(shí)體瘤中表達(dá)量均上調(diào)并有促癌癥作用(Chakravarty, Sboner et al. 2014)。此外，基于RNAi的shRNA文庫(kù)篩選也是常使用的方法。然而單純表達(dá)量差異的篩選無(wú)法與功能聯(lián)系起來(lái)。因此，利用CRISPR-Cas9的功能性高通量篩選技術(shù)研究lncRNAs成了我們的一大利器。早在2014年，張峰課題組就報(bào)道了針對(duì)所有蛋白編碼基因的CRISPR-Cas9篩選文庫(kù)(Shalem, Sanjana et al. 2014)；這一方法目前在研究中也廣泛使用。之后研究人員在此基礎(chǔ)上推出了針對(duì)不同基因群的亞庫(kù)、攜帶不同活性的融合蛋白的激活或抑制文庫(kù)等。近年來(lái)，許多高水平文章報(bào)道了通過(guò)該方法發(fā)現(xiàn)參與各中生物學(xué)過(guò)程的新基因。而針對(duì)lncRNAs的高通量文庫(kù)在2018年才有報(bào)道(Liu, Cao et al. 2018)。接下來(lái)讓我們來(lái)學(xué)習(xí)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)思路。

圖1 CRISPR-Cas Screen文庫(kù)構(gòu)建、感染和篩選模式圖

  如圖1所示，我們首先需要設(shè)計(jì)或購(gòu)買符合我們研究目標(biāo)的sgRNA文庫(kù)。例如Addgene 89640、 86538–86550、1000000106等，都十分方便研究者直接使用。這些文庫(kù)針對(duì)每一個(gè)lncRNA均設(shè)計(jì)6條sgRNA來(lái)提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。然后包裝病毒后感染細(xì)胞建立穩(wěn)定表達(dá)相應(yīng)Cas9蛋白和gRNA的細(xì)胞系。需要注意的是，使用含gRNA的病毒感染細(xì)胞時(shí)，MOI值應(yīng)較低（應(yīng)低于1，該文章推薦值為0.3），這樣才能保證單個(gè)細(xì)胞中只有單個(gè)lncRNA被編輯。通過(guò)抗生素等篩選方法去除未感染細(xì)胞后，便可以進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn)了。

  我們根據(jù)研究目的制定特定篩選策略。根據(jù)不同lncRNAs編輯后產(chǎn)生的不同表型篩選出目標(biāo)組別和對(duì)照組別。如根據(jù)侵襲能力不同分選出高侵襲能力的細(xì)胞和低侵襲能力的細(xì)胞；藥物處理后根據(jù)耐藥性分選不同表型的細(xì)胞；根據(jù)帶GFP熒光標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白的含量篩選目標(biāo)蛋白上調(diào)或下調(diào)的細(xì)胞類群。嚴(yán)格的篩選標(biāo)準(zhǔn)和合理的對(duì)照設(shè)置能使我們的篩選結(jié)果更加準(zhǔn)確有效。接下來(lái)便是檢測(cè)各自細(xì)胞亞群中有哪些lncRNAs被編輯。

圖2 CRISPR-Cas Screen篩選后測(cè)序檢測(cè)和分析模式圖

  提取相應(yīng)細(xì)胞基因組并使用特異性引物PCR出整合的sgRNA序列后構(gòu)建二代測(cè)序文庫(kù)測(cè)序，再通過(guò)生物信息學(xué)分析樣品中g(shù)RNA豐度，豐度變化的gRNA所對(duì)應(yīng)的lncRNA便是調(diào)控篩選條件過(guò)程的潛在分子靶標(biāo)。如此得到的靶標(biāo)均是在癌癥發(fā)生過(guò)程中有調(diào)節(jié)功能的lncRNA，在經(jīng)過(guò)分析和篩選后部分指標(biāo)并驗(yàn)證其功能后，便是你深入探究分子機(jī)制、大展身手的最佳時(shí)機(jī)。下面舉例展示部分文章的篩選和驗(yàn)證結(jié)果(Zhu, Li et al. 2016)，如圖3所示。文章在Huh7OC細(xì)胞中篩選了700個(gè)lncRNAs，發(fā)現(xiàn)其中51個(gè)能上調(diào)或下調(diào)該細(xì)胞的生長(zhǎng)。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中敲除AC004463.6（圖3 f中粉色標(biāo)注）后，癌細(xì)胞的生長(zhǎng)受到顯著抑制；敲除LINC01087（圖3 g中紅色標(biāo)注）后，癌細(xì)胞的生長(zhǎng)顯著增加。當(dāng)然，這種方法中也會(huì)存在著敲除作用是否高效，功能性篩選結(jié)果的機(jī)制研究困難等問(wèn)題。

圖3 部分篩選指標(biāo)驗(yàn)證結(jié)果

  上海英拜生物多年來(lái)一直聚焦于lncRNA、miRNA、cirRNA研究的前沿，在測(cè)序篩選、機(jī)制功能研究方面均有著豐富的經(jīng)驗(yàn)和眾多成功案例。更多資訊可查詢公司相關(guān)產(chǎn)品。