敲黑板：circRNA在膀胱癌中研究新進(jìn)展

      環(huán)狀RNA（circular RNA,circRNA）是一類具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，它所具有的高穩(wěn)定性、物種間的高保守性以及組織特異性等特點,已被研究者視為有望成為臨床診斷、治療及預(yù)后等新的分子生物標(biāo)志物及靶向治療靶點。circRNA在癌癥中的應(yīng)用也逐漸成為科研熱點，但是研究大多數(shù)集中在胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌等癌癥中，circRNA在膀胱癌中的表達(dá)模式和機制研究較少。今天，小編來給大家分享一篇最新發(fā)表在Molecular Cancer 上面的一篇關(guān)于circRNA在膀胱癌中的作用研究的文章。

      這里講述了circRNA作為競爭性內(nèi)源RNA(Competing endogenous RNA, ceRNA)機制來發(fā)揮作用的研究思路，這也是目前報道最多的circRNA經(jīng)典作用機制。
文章技術(shù)路線：

研究成果：
1.篩選出這個circ在膀胱癌中顯著下調(diào)并進(jìn)行了相關(guān)驗證
      篩選circRNA：根據(jù)以前的測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)下調(diào)基因比較多，挑選出下調(diào)基因的前五名，用20對配對的癌組織和癌旁組織進(jìn)行Q-P驗證，發(fā)現(xiàn)circSLC8A1下調(diào)最顯著。一代測序鑒定出，circSLC8A1是SLC8A1基因的外顯子1環(huán)化形成的。在70對膀胱癌組織和正常膀胱組織中檢測circSLC8A1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在癌組織中顯著下調(diào)，并且樣本中80%樣本組織中circSLC8A1的表達(dá)是降低的；另外，與正常的膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1相比較，circSLC8A1在六個腫瘤細(xì)胞系中都是低表達(dá)。之后，設(shè)計引物鑒定SLC8A1 circSLC8A1，用5637、T24細(xì)胞的cDNA和基因組DNA(Gdna)做模板進(jìn)行擴增，發(fā)現(xiàn)circSLC8A1僅在以外擴引物擴增cDNA中能檢測到，經(jīng)過Q-P也能確定circSLC8A1對RNA酶耐受

2. circSLC8A1的過表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞遷移侵襲（功能實驗）
      5637和T24細(xì)胞過表達(dá)circSLC8A1，同時SLC8A1 mRNA表達(dá)不受影響，劃痕實驗、transwell證明circSLC8A1過表達(dá)能顯著抑制腫瘤細(xì)胞遷移侵襲。之后通過小RNA降低circSLC8A1表達(dá)，但不影響SLC8A1 mRNA表達(dá)，同樣實驗發(fā)現(xiàn)細(xì)胞遷移侵襲能力增加

3.驗證完circSLC8A1的表達(dá)模式和功能開始尋找作用機制:先驗證公認(rèn)的海綿作用
      根據(jù)circSLC8A1的海綿作用尋找相關(guān)的miRNA，通過三種公開的預(yù)測工具選出7個候選miRNA，在兩種腫瘤細(xì)胞一株永生化細(xì)胞中通過pull-down實驗驗證他們與circSLC8A1是否直接相關(guān)。結(jié)果顯示miR-130b和miR-494是在3個腫瘤細(xì)胞系中都能被circSLC8A1拉下來的miRNA。用miRNA mimics進(jìn)一步驗證兩者的直接聯(lián)系，結(jié)果顯示mimics能捕捉更多的circSLC8A1。熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）實驗驗證了circSLC8A1和兩個miRNA都是在細(xì)胞質(zhì)中。以上三個實驗結(jié)果都證明了circSLC8A1能直接綁定miR-130b和miR-494

4.檢測miR-130b和miR-494在膀胱癌中的作用
      Q-P結(jié)果顯示2個miRNA在腫瘤組織上調(diào)，相關(guān)性分析顯示circSLC8A1與MiRNA是負(fù)相關(guān)。之后檢測2個miRNA過表達(dá)后對細(xì)胞功能的影響：CCK-8檢測細(xì)胞miRNA過表達(dá)顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，transwell顯示過表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞遷移侵襲，若抑制miRNA則抑制細(xì)胞遷移侵襲。有研究顯示miRNA能通過序列識別進(jìn)行mRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，通過軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)這2個miRNA能綁定PTEN的3′-UTR，熒光素酶報告基因?qū)嶒烇@示過表達(dá)2個miRNA能顯著降低PTEN表達(dá)，同時進(jìn)行WB驗證。Figure4主要檢測兩個miRNA的功能，并且篩選出其下游靶基因。以上只是找到了膀胱癌密切相關(guān)的circSLC8A1，并且找到與circSLC8A1有直接關(guān)系的miRNA及其下游靶基因，也驗證了miRNA在膀胱癌中的作用

5. 探究circSLC8A1能否通過調(diào)控miRNA進(jìn)而調(diào)控PTEN表達(dá)、抑制腫瘤進(jìn)展
      在腫瘤細(xì)胞內(nèi)共轉(zhuǎn)染這circSLC8A1和兩個miRNA，cck-8和transwell檢測發(fā)現(xiàn)circSLC8A1過表達(dá)抑制細(xì)胞遷移侵襲增殖能力，但當(dāng)miRNA也過表達(dá)后就很大程度上消弱circSLC8A1的抑制遷移侵襲增殖能力。并且，發(fā)現(xiàn)相對于只過表達(dá)circSLC8A1，共轉(zhuǎn)染circSLC8A1和miRNA能顯著降低PTEN的表達(dá)。之后在10對乳腺癌組織和正常癌旁癌癥檢測PTEN的表達(dá)， 發(fā)現(xiàn)癌組織中PTEN表達(dá)降低。以上得出結(jié)論circSLC8A1能充當(dāng)miRNA海綿進(jìn)而調(diào)控PTEN表達(dá)

6.體內(nèi)功能實驗
      T24細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染circSLC8A1，注射到BALB/c裸鼠皮下，之后每周測量長出來的腫瘤體積，發(fā)現(xiàn)與對照相比，過表達(dá)circSLC8A1的一組腫瘤生長速度慢，腫瘤重量都顯著減小，并且發(fā)現(xiàn)過表達(dá)circSLC8A1的腫瘤組織中circSLC8A1表達(dá)顯著上調(diào)，miR-130b和miR494表達(dá)顯著下調(diào)，免疫組化結(jié)果顯示PTEN表達(dá)升高。再次驗證了三者之間有緊密聯(lián)系
   已知PTEN是PI3K/AKT信號通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子，而MMP-9蛋白是腫瘤遷移的關(guān)鍵因子，它能被這個信號通路調(diào)控，所以免疫組化結(jié)果又檢測了AKT,P-AKT,MMP-9的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)circSLC8A1過表達(dá)能抑制AKT,P-AKT、MMP-9的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)都是表達(dá)降低體內(nèi)實驗證明circSLC8A1能調(diào)控PTEN表達(dá)抑制癌癥進(jìn)展

總結(jié)：
  1.找到靶點并發(fā)現(xiàn)circSLC8A1在膀胱癌中有作用
  2.探究circSLC8A1作用機制： circSLC8A1/miRNA-130b，miRNA-494/PTEN軸