是敵是友？?jī)?nèi)源性外泌體竟轉(zhuǎn)運(yùn)有功能的gRNA和Cas9蛋白

2019年7月4日，來(lái)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的研究團(tuán)隊(duì)在雜志small（IF=10.856）上報(bào)道了內(nèi)源性外泌體能轉(zhuǎn)運(yùn)有功能的gRNA和Cas9蛋白（doi: 10.1002/smll.201902686）(Chen, Huang et al. 2019)。讓我們一起來(lái)了解一下。

外泌體是廣泛存在于各種體液中的由細(xì)胞分泌的納米級(jí)囊泡，并攜帶有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和各類型核酸。它在許多生物過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用。一些外泌體中的miRNA、lncRNA等已被鑒定為腫瘤的診斷、預(yù)后標(biāo)志物或治療靶標(biāo)。在另一方面，它也被作為一種藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體被廣泛研究。除了對(duì)傳統(tǒng)藥物的包裝之外，對(duì)核酸以及CRISPR-Cas9相關(guān)的基因編輯治療藥物的包裝也是研究熱點(diǎn)。例如在Gulei D的報(bào)道中，通過(guò)在外泌體供體細(xì)胞中表達(dá)TNF-α獲得表面有TNF-α蛋白的外泌體，然后在將CRISPR-Cas9系統(tǒng)轉(zhuǎn)入外泌體中特異性的識(shí)別腫瘤細(xì)胞（圖1）(Gulei and Berindan-Neagoe 2019)。

                                         圖1 制備含TNF-α的外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)CRISPR系統(tǒng)

而本文中，作者首先提出問(wèn)題：外泌體是否能直接轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞內(nèi)的CRISPR-Cas9系統(tǒng)至其他細(xì)胞。作者以HBV穩(wěn)定復(fù)制的細(xì)胞HepAD38為模型，共轉(zhuǎn)染針對(duì)HBV的Cas9蛋白和一對(duì)sgRNA后，HBV的復(fù)制受到30%的抑制。而使用特異性抑制外泌體釋放的抑制劑GW4869處理后，CRISPR系統(tǒng)對(duì)HBV的抑制效果顯著降低。這預(yù)示著外泌體在這個(gè)過(guò)程中發(fā)揮著作用。作者便開(kāi)始驗(yàn)證外泌體中是否含有Cas9蛋白和gRNA。通過(guò)離心和CD63 pull-down的方法提取外泌體后，通過(guò)western blot和PCR分別檢測(cè)到了外泌體中Cas9蛋白和gRNA的存在。這表明內(nèi)源性外泌體能轉(zhuǎn)運(yùn)CRISPR-Cas9系統(tǒng)（圖2）。此外，作者也通過(guò)tCLN和TRIF的方法驗(yàn)證了外泌體中g(shù)RNA的存在。此外通過(guò)對(duì)載體片段和未逆轉(zhuǎn)錄樣品的PCR檢測(cè)，也證明了外泌體中轉(zhuǎn)運(yùn)的是gRNA而不是過(guò)表達(dá)載體。

                                          圖2 CRISPR過(guò)表達(dá)細(xì)胞外泌體中含有Cas9蛋白和gRNA

接下來(lái)，作者探究了外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)CRISPR-Cas9系統(tǒng)的機(jī)制。Cas9蛋白結(jié)合gRNA后發(fā)揮作用。那外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)Cas9蛋白和gRNA是否需要兩者結(jié)合呢？作者首先通過(guò)免疫熒光檢測(cè)到了CD63和Cas9蛋白的共定位。通過(guò)共轉(zhuǎn)和單轉(zhuǎn)Cas9和gRNA，作者發(fā)現(xiàn)單轉(zhuǎn)Cas9或gRNA后，兩者都能被外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)。這表明兩者被外泌體的轉(zhuǎn)運(yùn)并無(wú)相互依賴的關(guān)系（圖3）。

                                          圖3 Cas9蛋白和gRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)依賴關(guān)系

那么，外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)的CRISPR系統(tǒng)是否具有生物活性呢？作者將只表達(dá)針對(duì)HBV gRNA和Cas9的供體HuH 7細(xì)胞和只表達(dá)HBV的受體HuH 7細(xì)胞共培養(yǎng)；并以只表達(dá)Cas9的供體細(xì)胞為對(duì)照。PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，受體細(xì)胞中含有被編輯的HBV DNA片段。如圖4所示。此外，為了進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)運(yùn)CRISPR系統(tǒng)外泌體的生物學(xué)功能，作者從常見(jiàn)得生物工程細(xì)胞株Vero和CHO細(xì)胞中提取了含Cas9和gRNA的外泌體。該外泌體能作用于HuH 7細(xì)胞。共培養(yǎng)后也與上述結(jié)果一致，可以編輯受體細(xì)胞。

                                       圖4 外泌體中轉(zhuǎn)運(yùn)的CRISPR系統(tǒng)具有生物學(xué)活性

這一發(fā)現(xiàn)即對(duì)外泌體藥物轉(zhuǎn)運(yùn)研究提供助力，也對(duì)那些未發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas系統(tǒng)脫靶效應(yīng)和安全性做出警示。最后給出文章的模式圖（圖5）。

                                     圖5 外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)CRISPR系統(tǒng)并作用于受體細(xì)胞模式圖
Chen, R., H. Huang, et al. (2019). "Friend or Foe? Evidence Indicates Endogenous Exosomes Can Deliver Functional gRNA and Cas9 Protein." Small: e1902686.
Gulei, D. and I. Berindan-Neagoe (2019). "Activation of Necroptosis by Engineered Self Tumor-Derived Exosomes Loaded with CRISPR/Cas9." Mol Ther Nucleic Acids 17: 448-451.