條條大路通羅馬，這條回路向肝癌

LncRNA與癌癥的捆綁研究已不算少見，最近，Cancer Research （IF=8.378）上發(fā)表了一篇名為“LncRNA SNHG10 Facilitates Hepatocarcinogenesis and Metastasis by Modulating Its Homolog SCARNA13 via a Positive Feedback Loop”的文章，文章的作者們通過一系列的實驗，發(fā)現(xiàn)了在肝癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中存在的一個復(fù)雜回路，揭示了LncRNA SNHG10是如何通過正反饋環(huán)調(diào)節(jié)其同源SCARNA13，以促進(jìn)肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移的，為肝癌的治療提供了一條新的清晰思路。

摘要：
弄清非編碼RNA（ncRNA）在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中的作用可以為疾病診斷和靶向治療開辟新的途徑。本次研究以鑒別肝細(xì)胞癌（HCC）特異性ncRNA并研究其在肝癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中的作用為目標(biāo)。肺轉(zhuǎn)移引起的異種移植物的RNA-seq鑒定出的長鏈非編碼RNA小核仁RNA宿主基因10（SNHG10）及其同源SCARNA13，是HCC發(fā)展和轉(zhuǎn)移的新驅(qū)動因子。在64例HCC中，SNHG10的表達(dá)與SCARNA13的表達(dá)程正相關(guān)，且SNHG10或SCARNA13的高表達(dá)與總生存期差有關(guān)。在過表達(dá)或敲除SNHG10后，SCARNA13分別表現(xiàn)出明顯的升高和下降，我們猜測SNHG10可能是SCARNA13的上游調(diào)控因子。SNHG10和SCARNA13協(xié)同促進(jìn)HCC細(xì)胞的惡性表型，其中SNHG10充當(dāng)miR-150-5p的海綿，并與RPL4 mRNA相互作用，以增強(qiáng)c-Myb的表達(dá)和活性。反之，c-Myb的上調(diào)和超激活通過調(diào)控SNHG10啟動子活性，形成正反饋環(huán)，持續(xù)刺激SCARNA13表達(dá)，從而增強(qiáng)SNHG10和SCARNA13的表達(dá)。SCARNA13介導(dǎo)SNHG10驅(qū)動的HCC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，并通過調(diào)節(jié)SOX9促進(jìn)HCC細(xì)胞的細(xì)胞周期和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化?？傮w而言，我們發(fā)現(xiàn)在肝癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中，SNHG10及其同源物SCARNA13的伴隨上調(diào)背后的一個復(fù)雜回路。
意義：這些發(fā)現(xiàn)揭示了非編碼RNA在肝細(xì)胞癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移中的作用。
結(jié)果：

一.SNHG10和SCARNA13在肺轉(zhuǎn)移灶和HCC組織中升高，并且與HCC患者的不良預(yù)后相關(guān)
為鑒定參與HCC轉(zhuǎn)移的ncRNAs，研究者首先建立肺轉(zhuǎn)移篩查小鼠模型(圖1A)，通過RNA-seq結(jié)果與TCGA LIHC數(shù)據(jù)存儲庫的交集選擇候選lncRNA和snoRNA (圖1B，1C)。通過交叉，24個lncRNAs和6個snoRNAs被認(rèn)為可能在HCC的形成和轉(zhuǎn)移中起重要作用。研究者發(fā)現(xiàn)在這些異常表達(dá)的基因中有SNHG10和SCARNA13，它們是同一初級RNA轉(zhuǎn)錄本的不同產(chǎn)物，SCARNA13是從SNHG10基因的初級RNA轉(zhuǎn)錄本的內(nèi)含子加工而成的，而外顯子被剪接到SNHG10轉(zhuǎn)錄本中(圖1D)。SCARNA13的表達(dá)與SNHG10的表達(dá)具有統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性(圖1E)。采用qPCR方法檢測64對HCC組織及癌旁正常組織中SNHG10和SCARNA13的表達(dá)，HCC組織中SNHG10和SCARNA13水平均高于癌旁正常組織(圖1F和G)，并且二者之間存在統(tǒng)計學(xué)上的正相關(guān)關(guān)系(圖1H)。Kaplan-Meier分析顯示SNHG10或SCARNA13的高表達(dá)與較差的總生存率顯著相關(guān)(圖1I和J)。用qPCR方法檢測SNHG10在5種不同肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)，與其他細(xì)胞相比，HCCLM3和SNU-387細(xì)胞的SNHG10表達(dá)相對較高(圖1K)。這些結(jié)果表明SNHG10可能是SCARNA13的上游調(diào)控因子。（數(shù)據(jù)采用Mean±SEM表示。** , P < 0.01.）

二.SNHG10促進(jìn)HCC細(xì)胞的形成和轉(zhuǎn)移
EDU免疫熒光染色分析結(jié)果顯示，SNHG10的損耗顯著抑制SNU-387和HCCLM3細(xì)胞周期和增殖，并誘導(dǎo)凋亡(圖2A和B)。Transwell侵襲試驗結(jié)果顯示SNHG10沉默極大地削弱了SNU-387和HCCLM3細(xì)胞的侵襲和遷移能力(圖2C和D)。為進(jìn)一步研究SNHG10對肝癌細(xì)胞的體內(nèi)致瘤作用，研究者將SNU-387和HCCLM3細(xì)胞皮下注射到裸鼠體內(nèi)。LV-shSNHG10組腫瘤的體積和重量均顯著低于LV-shCtrl組(圖2E-G)。構(gòu)建用于肝轉(zhuǎn)移檢測的原位移植模型以評估SNHG10對肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用，與LV-shCtrl組相比，LV-shSNHG10組肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的熒光素酶信號強(qiáng)度顯著降低(圖2H)，證明SNHG10增強(qiáng)了HCC細(xì)胞的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移能力。最后，用螢火蟲熒光素酶標(biāo)記SNU-387和HCCLM3細(xì)胞，直接接種裸鼠尾靜脈進(jìn)行肺轉(zhuǎn)移檢測，LV-shSNHG10組小鼠的熒光素酶信號強(qiáng)度明顯低于LV-shCtrl組(圖2I)，說明SNHG10可促進(jìn)HCC細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移潛能。H&E染色顯示LV-shSNHG10組肺和肝臟組織切片中的轉(zhuǎn)移灶顯著減少(圖2J和K)。（數(shù)據(jù)采用Mean±SEM表示。** , P < 0.01; *** , P < 0.001.）

三.SCARNA13促進(jìn)HCC細(xì)胞的腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移
由于SCARNA13和SNHG10在HCC組織中同時上調(diào)，研究者們評估了SCARNA13對HCC細(xì)胞惡性表型的影響。與SNHG10相似，敲除SCARNA13極大地抑制了細(xì)胞周期和增殖，并誘導(dǎo)SNU-387和HCCLM3凋亡(圖3A-H)。此外，SCARNA13的下調(diào)大大削弱了SNU-387和HCCLM3細(xì)胞的侵襲和遷移能力(圖3I-L)。這些結(jié)果表明SCARNA13是HCC中的致癌啟動子。

Figure 3.抑制SCARNA13阻礙HCC細(xì)胞在體外的增殖和轉(zhuǎn)移。A and B, CCK-8檢測轉(zhuǎn)染SCARNA13 ASOs或?qū)φ战M的SNU-387和HCCLM3細(xì)胞。C and D, 用碘化丙啶染色檢測轉(zhuǎn)染SCARNA13 ASOs或?qū)φ战M的SNU-387和HCCLM3細(xì)胞的細(xì)胞周期分布，并進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。E and F, 對轉(zhuǎn)染SCARNA13 ASOS或?qū)φ战M的SNU-387和HCCLM3細(xì)胞進(jìn)行EDU免疫熒光染色分析。比例尺，100μm。G and H, 采用FITC-Annexin V和碘化丙鈉染色法檢測轉(zhuǎn)染SCARNA13 ASOs或?qū)φ战M的SNU-387和HCCLM3細(xì)胞的凋亡情況，并進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。 I and J, 轉(zhuǎn)染SCARNA13 ASOS或?qū)φ战M的SNU-387和HCCLM3細(xì)胞的Transwell侵襲試驗。比例尺，100μm. K and L, 轉(zhuǎn)染SCARNA13 ASOS或?qū)φ战M的SNU-387和HCCLM3細(xì)胞的傷口愈合遷移試驗。比例尺，100μm。數(shù)據(jù)采用Mean±SEM表示。ns，不顯著；** , P < 0.01; *** , P < 0.001。
四、轉(zhuǎn)錄因子c-Myb上調(diào)SNHG10和SCARNA13水平
轉(zhuǎn)錄因子(TF)在識別和動態(tài)結(jié)合位于啟動子的簡并序列基序中的作用在轉(zhuǎn)錄中起著關(guān)鍵作用。研究者推測某些TF是否導(dǎo)致SNHG10和SCARNA13的異常表達(dá)。通過Jaspar、PROMO和LASAGNA數(shù)據(jù)庫的交集確定了9個可能與SNHG10基因的啟動子區(qū)域結(jié)合的TFs(圖4A)。對TCGA LIHC數(shù)據(jù)集的分析表明，在9個TF中，c-Myb表達(dá)與SNHG10和SCARNA13表達(dá)相關(guān)性最高(圖4B和C)。c-Myb的敲除顯著降低了SNU-387和HCCLM3細(xì)胞中SNHG10和SCARNA13的表達(dá)(圖4D和E)，c-Myb是SNHG10和SCARNA13的上游調(diào)節(jié)因子。生物信息學(xué)分析預(yù)測SNHG10的啟動子區(qū)域中有5個c-Myb結(jié)合位點(diǎn)(MBS)(圖4F和G)。ChIP分析證實c-Myb在SNHG10啟動子區(qū)域的MBS1和MBS3上顯著高富集(圖4H)。為了進(jìn)一步確定c-Myb在SNHG10基因啟動子上的轉(zhuǎn)錄激活，將SNHG10啟動子熒光素酶報告基因(pEZX-PL01-SNHG10)和靶向c-Myb的siRNA共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。c-Myb的缺失顯著降低了HEK293T細(xì)胞中SNHG10啟動子的活性(圖4I)（數(shù)據(jù)采用Mean±SEM表示。ns，不顯著；* ，P < 0.05; *** , P < 0.01; *** , P < 0.001）。這些數(shù)據(jù)表明c-Myb可以直接與SNHG10的啟動子區(qū)域結(jié)合，導(dǎo)致SNHG10和SCARNA13在HCC細(xì)胞中的上調(diào)。

五、SNHG10作為miR-150-5p的海綿增加c-Myb的表達(dá)
使用RNA FISH以確認(rèn)SNHG10和SCARNA13的定位，發(fā)現(xiàn)SNHG10主要定位于細(xì)胞質(zhì)，而SCARNA13優(yōu)先位于細(xì)胞核(圖5A)。細(xì)胞質(zhì)lncRNAs可以作為競爭內(nèi)源性RNA(ceRNA)來隔離miRNAs，導(dǎo)致相應(yīng)的miRNA靶向mRNAs的釋放。利用生物信息學(xué)分析預(yù)測SNHG10與miR-150-5p之間的結(jié)合位點(diǎn)。(圖5B)。RIP檢測SNU-387和HCCLM3細(xì)胞中SNHG10和miR-150-5p在Ago2上相對于IgG的富集情況，以驗證SNHG10和miR-150-5p是否參與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC) (圖5C和D)。ChiRP分析在SNU-387和HCCLM3細(xì)胞中SNHG10和miR-150-5p在偶數(shù)和奇數(shù)探針池中相對于設(shè)置的對照LacZ探針的富集情況，以確定SNHG10與miR-150-5p之間的直接相互作用 (圖5E和F)。miR-150-5p mimics的轉(zhuǎn)染顯著抑制了含有全長SNHG10的pmirGLO-SNHG10在Rluc的30個UTR處的熒光素酶活性。相反，pmirGLO-SNHG10-mut(miR-150-5p)對miR-150-5p(圖5G)沒有反應(yīng)。Western blot分析在miR-150-5p模擬物或抑制劑作用下的HCC細(xì)胞中的c-Myb (圖5H ，5I)。這些發(fā)現(xiàn)表明SNHG10作為miR-150-5p的海綿，可以降低其對c-Myb的抑制作用，從而增強(qiáng)c-Myb的表達(dá)。

六、SNHG10通過miR-150-5p/RPL4-c-Myb-正反饋環(huán)調(diào)節(jié)SCARNA13的表達(dá)
CARNA13是由SNHG10，miR-150-5p和c-Myb組成的正反饋環(huán)的下游效應(yīng)器。
當(dāng)c-Myb siRNA在RNA和蛋白質(zhì)水平上完全逆轉(zhuǎn)LV-SNHG10細(xì)胞中的c-Myb上調(diào)時，SCARNA13的表達(dá)在統(tǒng)計學(xué)上仍高于以前，這暗示SNHG10可能不僅僅通過調(diào)節(jié)c-Myb的表達(dá)來調(diào)節(jié)SCARNA13，此后，通過進(jìn)一步的挽救實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)與miR-150-5p抑制劑和c-Myb siRNA共轉(zhuǎn)染后，LV-Control細(xì)胞中c-Myb的表達(dá)在RNA和蛋白質(zhì)水平上保持穩(wěn)定，SCARNA13的表達(dá)沒有明顯變化(圖6A)，由此可見，c-Myb的表達(dá)水平是SNHG10過表達(dá)導(dǎo)致SCARNA13表達(dá)上調(diào)的部分原因。研究者推測SNHG10結(jié)合的某些mRNAs可能調(diào)節(jié)c-Myb的功能活性，因此從chirp-seq結(jié)果與BioGRID交互數(shù)據(jù)庫的交叉點(diǎn)中篩選出RPL4和DDB1。(圖6B)。與DDB1相比，在TCGA LIHC數(shù)據(jù)集中，RPL4與SNHG10顯示出明顯更高的相關(guān)性(圖6C和D)。Chirp法檢測在SNU-387和HCCLM3細(xì)胞中RPL4 mRNA在偶數(shù)和奇數(shù)探針池中相對于設(shè)置的對照LacZ探針的富集程度(圖6E和F)。用Dactinomycin處理SNU-387和HCCLM3細(xì)胞，以阻斷新RNA的合成，并在24小時內(nèi)測量RPL4的丟失百分比。研究結(jié)果表明，SNHG10的過度表達(dá)延長了RPL4 mRNA的半衰期(圖6G和H)。研究者構(gòu)建含有c-Myb識別元件(MRE)的熒光素酶報告基因以評價RPL4對肝癌細(xì)胞中c-Myb功能活性的正向調(diào)控作用。熒光素酶報告分析顯示RPL4可以增強(qiáng)MRE的活性(圖6I)。共免疫沉淀試驗以確定RPL4與c-Myb之間的相互作用，驗證了RPL4在抗c-Myb組中的富集程度顯著高于IgG組(圖6J)。反之，與IgG組相比，抗RPL4組的c-Myb豐度顯著增加(圖6k)。進(jìn)一步的搶救實驗表明，在與c-Myb siRNA和RPL4 siRNA共轉(zhuǎn)染后，SCARNA13的表達(dá)在LV-SNHG10細(xì)胞中沒有任何統(tǒng)計學(xué)變化(圖6L)。這些數(shù)據(jù)表明，SNHG10一方面通過吸收miR-150-5p促進(jìn)c-Myb的表達(dá)，另一方面通過與RPL4相互作用增強(qiáng)c-Myb的轉(zhuǎn)錄活性，從而調(diào)節(jié)SCARNA13的表達(dá)。（數(shù)據(jù)采用Mean±SEM表示。ns，不顯著；* , P < 0.05; ** , P < 0.01; *** , P < 0.001.）

七、SCARNA13通過調(diào)節(jié)SOX9介導(dǎo)SNHG10驅(qū)動的HCC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移
將SCARNA13 ASO轉(zhuǎn)染到LV-SNHG10細(xì)胞，EDU免疫熒光染色檢測和Transwell侵襲實驗發(fā)現(xiàn)敲除SCARNA13顯著挽救了SNHG10過表達(dá)對細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響(圖7A和B)。通過轉(zhuǎn)錄學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的交叉鑒定了11個SCARNA13的下游基因。(圖7C)。其中SOX9的表達(dá)在SCARNA13敲除后在蛋白質(zhì)水平上表現(xiàn)出最顯著的下降。SCAR轉(zhuǎn)染SCARNA13 ASOs或?qū)φ战M的SNU-387和HCCLM3細(xì)胞中，SOX9在RNA和蛋白水平上的表達(dá)顯著降低(圖7D-F)。Western blot分析轉(zhuǎn)染SCARNA13 ASOs或?qū)φ战M的SNU-387和HCCLM3細(xì)胞的細(xì)胞周期和EMT的分子標(biāo)記(圖7G)。這些發(fā)現(xiàn)說明SNHG10對腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用是通過SCARNA13介導(dǎo)的，SCARNA13通過上調(diào)HCC細(xì)胞中的SOX9來促進(jìn)細(xì)胞周期和EMT。
（圖7H）肝癌細(xì)胞中SNHG10和SCARNA13同時上調(diào)的復(fù)雜電路的示意圖模型。（數(shù)據(jù)采用Mean±SEM表示。** , P < 0.01; *** , P < 0.001）

結(jié)論：
研究者在HCC中發(fā)現(xiàn)了一個復(fù)雜的回路，它與肝癌中SNHG10及其同源SCARNA13的上調(diào)有關(guān)。SNHG10通過海綿miR-150-5p并與RPL4 mRNA相互作用調(diào)節(jié)c-Myb，調(diào)節(jié)HCC細(xì)胞中SCARNA13及其下游效應(yīng)子SOX9的表達(dá)。