circTP63上調(diào)FOXM1促進(jìn)肺鱗狀細(xì)胞癌進(jìn)展的ceRNA機(jī)制研究
導(dǎo)語：
在這里，我們探索5個LUSC配對樣本中circRNA和mRNA的表達(dá)譜。 通過分析差異表達(dá)的circRNA和失調(diào)的mRNA的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，尋找出關(guān)鍵的調(diào)節(jié)基因——circTP63。
結(jié)果分析：
1、circTP63在LUSC中上調(diào)表達(dá)：
通過同時分析circRNA 和mRNA在5對配對的LUSC樣品和健康組織中的表達(dá)譜，一共鑒定出7081個異常表達(dá)的circRNA，其中上調(diào)的有3157，下調(diào)的有3924個，差異表達(dá)的mRNA鑒定出2932個，其中上調(diào)的有979個，下調(diào)的有1853個（圖1a step 1， 圖1b）。選出差異最顯著的前50個circRNA，從KEGG分析中挑選最顯著的細(xì)胞周期途徑中的109個基因，對50個circRNA和109個mRNA做共表達(dá)分析（圖1a step 2，圖1 c），篩選出6個可能參與細(xì)胞調(diào)控的circRNA（圖1a step 3）。對這6個circRNA做RNase R酶消化處理和RT-PCR驗證，篩選出hsa_circ_0068515（circTP63）（圖1a step 4，圖1 d）。微陣列數(shù)據(jù)分析顯示circTP63上調(diào)表達(dá)（圖1e），qRT-PCR結(jié)果顯示circTP63在LUSC組織中顯著上調(diào)表達(dá)（圖1f）。并且LUSC組織中circTP63的表達(dá)增加與腫瘤體積的增大和患者TNM分期的升高呈顯著相關(guān)（Table 1）。
圖1 circRNA表達(dá)圖揭示circTP63在LUSC中上調(diào)表達(dá)
2、circTP63在LUSC細(xì)胞中的特征
作者評估了circTP63的外顯子結(jié)構(gòu)，circTP63是由CTP63基因的10到11的外顯子反向剪切連接衍生而來（圖2a）。PCR分析表明不同的引物可以擴(kuò)增來自cDNA的產(chǎn)物，但不能擴(kuò)增來自gDNA的產(chǎn)物（圖2b）。Northern blot結(jié)果表明circTP63可以在295nt出檢測到，與預(yù)測大小一致（圖2c）。用轉(zhuǎn)錄抑制劑Dactinomycin處理的H1703細(xì)胞中circTP63和TP63，結(jié)果表明circTP63的半衰期超過24h，穩(wěn)定性比TP63好（圖2d）。circTP63轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物優(yōu)先定位于細(xì)胞質(zhì)中（圖2e）。
圖2 circTP63在LUSC細(xì)胞中的特征
3、circTP63促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤生長
我們發(fā)現(xiàn)在SW900和H1703細(xì)胞中，circTP63 siRNAs可以成功地下調(diào)circTP63的表達(dá)，但對TP63 mRNA的表達(dá)沒有影響（圖3a）。circTP63在H226和H2170細(xì)胞中過表達(dá)，TP63 mRNA表達(dá)無明顯變化（圖3b）。表明TP63的表達(dá)不受circTP63的影響。沉默circTP63可以明顯抑制細(xì)胞增長（圖3c）。穩(wěn)定過表達(dá)circTP63可以顯著提高細(xì)胞的存活率（圖3d）。細(xì)胞周期分析表明，與對照組相比，沉默circTP63可減少G2/M期細(xì)胞數(shù)量，但增加G1期細(xì)胞數(shù)量（圖3e）。circTP63的異位表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞從G1/S期向G2/M期發(fā)展（圖3f）。我們發(fā)現(xiàn)circTP63的過表達(dá)顯著增加了H2170細(xì)胞的腫瘤生長，circTP63可顯著提高腫瘤體積和重量（圖3g）。si-circTP63明顯抑制了H1703中腫瘤的生長（圖3h）。
圖3 circTP63促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤生長
4、circTP63通過靶向FOXM1促進(jìn)細(xì)胞增殖
在共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中，根據(jù)Pearson相關(guān)系數(shù)值篩選25個相關(guān)的mRNA（圖4a）。微陣列數(shù)據(jù)顯示，25個mRNA在LUSC組織中顯著上調(diào)，F(xiàn)OXM1在LUSC中上調(diào)超過8倍（圖4b）。我們進(jìn)一步確認(rèn)了35對LUSC樣品中FOXM1的上調(diào)水平（圖4c）。與KIF18B或BRCA1相比，circTP63的表達(dá)與FOXM1呈最顯著的正相關(guān)（圖4d）。FOXM1在LUSC組織中顯著上調(diào)，與circTP63呈正相關(guān)(圖4e)。qRT-PCR和western blot結(jié)果顯示，circTP63敲低顯著降低了FOXM1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，而當(dāng)circTP63過表達(dá)時則相反(圖4f)。因此認(rèn)為FOXM1是circTP63的一個重要靶基因。FOXM1的敲除可以抵消circTP63促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用(圖4g)，而FOXM1的過表達(dá)可以通過敲除circTP63，顯著挽救H1703細(xì)胞的增殖抑制(圖4h)。
圖4 circTP63通過靶向FOXM1促進(jìn)細(xì)胞增殖
5、circTP63可以減輕miR-873-3p對FOXM1的抑制
構(gòu)建了circtp63 - miRNA - foxm1網(wǎng)絡(luò)，包括22個候選miRNA，包含circTP63和FOXM1的共同結(jié)合位點(圖5a)。我們觀察到多個miRNA能夠降低熒光素酶活性，其中miR-873-3p下降最多，至少80%(圖5b)。然后作者構(gòu)建了AGO2免疫沉淀系統(tǒng)檢測circTP63是否作為AGO2和miR-873-3p的平臺，如圖5c所示，轉(zhuǎn)染細(xì)胞中circTP63在miR-873-3p中特異性富集。熒光素酶報告基因檢測顯示，與對照或突變相比，轉(zhuǎn)染miR-873-3p后，circTP63或FOXM1野生型報告基因的熒光素酶活性顯著降低(圖5 d)。作者發(fā)現(xiàn)，circTP63過表達(dá)或敲除可以進(jìn)一步增加或降低FOXM1野生型報告基因的熒光素酶活性(圖5e)。在miR-873-3p捕獲的分?jǐn)?shù)中，與陰性對照組比較，circTP63和FOXM1分別有近三倍和近六倍的富集，過表達(dá)circTP63 會導(dǎo)致FOXM1 在miR-873-3p 中的富集減少(圖5f)。作者還在細(xì)胞中評估了過表達(dá)miR-873-3p后FOXM1的表達(dá)。結(jié)果表明，miR-873-3p顯著降低了FOXM1表達(dá)，但circTP63過表達(dá)挽救了FOXM1的表達(dá)(圖5g)。作者研究了miR-873-3p對細(xì)胞增殖的影響，miR-873-3p過表達(dá)抑制細(xì)胞增殖，而circTP63過表達(dá)可挽救miR-873-3p介導(dǎo)的細(xì)胞增殖和周期抑制(圖5h)。
圖5 circTP63可以減輕miR-873-3p對FOXM1的抑制
6、circTP63通過FOXM1調(diào)控CENPA和CENPB
在circTP63過表達(dá)后檢測8個候選基因的mRNA水平，結(jié)果表明，CENPA、CENPB、CCNB1均受circTP63調(diào)控，另有5細(xì)胞周期相關(guān)基因無明顯變化(圖6a)。FOXM1 siRNAs顯著減弱了circTP63對CENPA和CENPB的影響(圖6b)。細(xì)胞增殖分析表明，單獨敲除CENPA或CENPB可降低circTP63過表達(dá)對細(xì)胞增殖的影響，當(dāng)同時敲除CENPA和CENPB時，細(xì)胞增殖抑制作用更為顯著(圖6c)。FOXM1的升高可促進(jìn)CENPA和CENPB的表達(dá)，然后驅(qū)動細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞增殖(圖6d)。
圖6 circTP63通過FOXM1調(diào)控CENPA和CENPB
結(jié)論：
circTP63競爭性結(jié)合miR-873-3p，消除miR-873-3p對FOXM1的抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖。
參考文獻(xiàn)：
Cheng Zhuoan,Yu Chengtao,Cui Shaohua et al. circTP63 functions as a ceRNA to promote lung squamous cell carcinoma progression by upregulating FOXM1.[J] .Nat Commun, 2019, 10: 3200. IF：11.878