揭秘一種新的參與白血病調(diào)控的LncRNA

      LncRNAs是一類長(zhǎng)度大于200 nt不編碼蛋白質(zhì)的核苷酸，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在多種人類疾病中均有異常表達(dá)，包括癌癥。9號(hào)染色體和22號(hào)染色體相互易位產(chǎn)生嵌合的Bcr-Abl癌基因，該基因與幾種血液病有關(guān)。然而，LncRNAs的異常表達(dá)與Bcr-Abl介導(dǎo)的白血病之間的相關(guān)性功能仍不清楚。
      今年，Xuefei Wang等人在Mol Cancer發(fā)表一篇 “Novel lncRNA-IUR suppresses Bcr-Abl-induced tumorigenesis through regulation of STAT5-CD71 pathway”的SCI文章，該研究旨在綜合評(píng)價(jià)經(jīng)伊馬替尼 （Imatinib）處理的人K562白血病細(xì)胞中LncRNAs的表達(dá)情況。
技術(shù)路線：

一、鑒定伊馬替尼處理白血病細(xì)胞后上調(diào)的lncRNAs

利用lncRNA cDNA芯片分析在K562細(xì)胞中表達(dá)的LncRNAs，圖A表示伊馬替尼處理或不處理組，差異表達(dá)的LncRNAs聚類分析，987個(gè)上調(diào)LncRNA，1479個(gè)下調(diào)LncRNA。圖B表示伊馬替尼處理后顯著上調(diào)的一個(gè)LncRNA 家族(Imatinib -upregated LncRNA，簡(jiǎn)稱為lncRNA-IUR)，該LncRNA 家族有多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，人來(lái)源的有8個(gè)轉(zhuǎn)錄本，鼠來(lái)源的有5個(gè)轉(zhuǎn)錄本。圖C表示qPCR證明在K562白血病細(xì)胞中伊馬替尼處理組相對(duì)于對(duì)照組lncRNA-IUR表達(dá)上調(diào)，lncRNA-IUR-5，6，8的表達(dá)具有顯著性差異。圖D表示qPCR證明在v-Abl轉(zhuǎn)化的小鼠NS2細(xì)胞株中伊馬替尼處理組相對(duì)于對(duì)照組lncRNA-IUR表達(dá)上調(diào)，lncRNA-IUR-4，5，6，8觀察到類似的的表達(dá)具有顯著性差異，與圖C結(jié)果一致。圖E和F表示從蛋白水平與RNA水平，BCR-Abl陽(yáng)性患者外周血淋巴細(xì)胞lncRNA-IUR的表達(dá)顯著低于正常人外周血淋巴細(xì)胞。上述結(jié)果表明，在Abl轉(zhuǎn)化的白血病細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-IUR的表達(dá)受到抑制，然而伊馬替尼可誘導(dǎo)lncRNA-IUR表達(dá).
此外，通過(guò)軟件預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)分析lncRNA-IUR的編碼潛力.進(jìn)一步運(yùn)用the Open Reading Frame (ORF) Finder，發(fā)現(xiàn)lncRNA-IUR每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的ORF總長(zhǎng)度小于300 bp。在UniProtKB/ swissprot(Swissprot)數(shù)據(jù)庫(kù)中也沒(méi)有預(yù)測(cè)到lncRNA-IUR的匹配肽。此外，運(yùn)用Coding Potential Calculator (CPC)軟件評(píng)估lncRNA-IUR家族是否具備編碼能力，圖G表示每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的CPC評(píng)分為負(fù)，表明lncRNA-IUR家族“非編碼”。圖I表示在體外翻譯實(shí)驗(yàn)中，我們能夠觀察對(duì)照基因KU70的蛋白帶(約70kD)，但未能檢測(cè)lncRNA-IUR-5、6或8的任何蛋白條帶。為了進(jìn)一步證明lncRNA-IUR沒(méi)有編碼能力，通過(guò)RACE試驗(yàn)鑒定了一段全長(zhǎng)的lncRNA-IUR-5(2342 nt)。
二、lncRNA-IUR影響abl轉(zhuǎn)化細(xì)胞存活及體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)

我們研究了在異種移植小鼠模型中，為了證明lncRNA-IUR是否對(duì)細(xì)胞存活和腫瘤形成有影響，運(yùn)用shRNAs生成了lncRNA-IUR (sh- IUR -5，-6和-8)的K 562細(xì)胞株或熒光素以及顯示熒光的對(duì)照細(xì)胞，圖A表示lncRNA-IUR (sh- IUR -5，-6和-8)的K 562細(xì)胞lncRNA-IUR的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組明顯降低，表明敲減成功。圖B表示Imatinib濃度越高，K562細(xì)胞的生存率降低，lncRNA-IUR抑制細(xì)胞生存。圖C和D表示采用異種移植小鼠模型，每只小鼠皮下接種表達(dá)shlncRNA-IUR的K562細(xì)胞，敲減lncRNA-IUR-5，6，8基因顯著促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。在V-ABL-轉(zhuǎn)化的NS2細(xì)胞系，并使用SH- IUR -M45678敲減小鼠lncRNA-IUR-5，圖F表示在NS2細(xì)胞中，敲減shlncRNA-IUR促進(jìn)了細(xì)胞的存活。此外，圖G表示sh- IUR--m45678的NS2細(xì)胞所形成的腫瘤比對(duì)照組大得多。實(shí)時(shí)定量PCR也證實(shí)了sh- IUR--m45678組相對(duì)于對(duì)照組 INcRNA-IUR在腫瘤中的表達(dá)下調(diào)。這些結(jié)果表明，無(wú)論在K562細(xì)胞還是在異種移植小鼠模型中，敲減INcRNA-IUR促進(jìn)Abl轉(zhuǎn)化的白血病細(xì)胞的存活和腫瘤的生長(zhǎng)。

與上述結(jié)果一致，只是一種運(yùn)用敲減INcRNA-IUR的方法，一種運(yùn)用過(guò)表達(dá)INcRNA-IUR的方法，在異種移植小鼠模型中，過(guò)表達(dá)INcRNA-IUR抑制Abl轉(zhuǎn)化的白血病細(xì)胞的存活和腫瘤的生長(zhǎng)。
三、在體內(nèi)敲減鼠LncRNA-IUR促進(jìn)ABL介導(dǎo)的骨髓細(xì)胞轉(zhuǎn)化和白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)

 A、LncRNA-IUR- KD轉(zhuǎn)基因小鼠及WT小鼠的照片。B、RT-PCR檢測(cè)LncRNA-IUR- KD轉(zhuǎn)基因及WT小鼠中肺、脾、肝、胸腺和骨髓器官LncRNA-IUR -M5的表達(dá).C、WT和KD小鼠中Bcr-Abl轉(zhuǎn)化BMC細(xì)胞的存活克隆數(shù)，KD小鼠的轉(zhuǎn)化效率顯著高于野生型小鼠。D、通過(guò)注射表達(dá)sh- IUR -m45678，sh-luc的GFP陽(yáng)性NS2細(xì)胞來(lái)建立白血病移植小鼠模型，三組分別標(biāo)記為SH-Iur-M45678組、SH-Luc組和陰性對(duì)照組。E、白血病移植后8天后，生物發(fā)光成像顯示穩(wěn)定表SH-Iur-M45678或SH-Luc的GFP陽(yáng)性NS2細(xì)胞在WT小鼠體內(nèi)分布。F、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠白血病移植后第6與第9天外周血單個(gè)核細(xì)胞的變化。這些結(jié)果表示敲減鼠LncRNA-IUR促進(jìn)體內(nèi)ABL介導(dǎo)的骨髓細(xì)胞(BMC)轉(zhuǎn)化和NS2細(xì)胞的生長(zhǎng)。
四、轉(zhuǎn)基因小鼠沉默LncRNA-Iur為Abl介導(dǎo)的白血病的發(fā)生發(fā)展提供了理想的微環(huán)境。

A、建立KD和WT小鼠白血病移植模型， LncRNA-Iur-KD與WT小鼠在輻射后通過(guò)尾部靜脈注入GFP陽(yáng)性NS2細(xì)胞或等體積的PBS，實(shí)驗(yàn)組標(biāo)記為NS2KD和NS2WT，對(duì)照組為PBS-KD和PBS-WT。 B、顯示NS2-KD和NS2-WT小鼠在體內(nèi)白血病移植后的第8天的代表性照片。C和D分別表示有缺陷的老鼠的體重(C)和存活率(D)，每組小鼠8-10只。對(duì)小鼠進(jìn)行為期15天的監(jiān)測(cè)。E、生物發(fā)光成像實(shí)驗(yàn)觀察GFP陽(yáng)性NS2細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的分布情況.F、流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞中GFP陽(yáng)性NS2細(xì)胞的百分率。三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，選擇代表性的圖像。G、HE染色小鼠脾臟。
五、LncRNA-IUR-5負(fù)調(diào)節(jié)STAT5介導(dǎo)的CD71表達(dá)

A、LncRNA-IUR-5敲除k562細(xì)胞系和對(duì)照細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組RNA測(cè)序分析。箭頭表示CD71蛋白的三種亞型。B、 Western blot分析LncRNA-IUR-5基因敲除或過(guò)表達(dá)K562細(xì)胞株CD71 蛋白的表達(dá)水平。C-E 、Westernblotting證明分別用伊馬替尼(C)、STAT5-In-1(50μM，6h)（D）或sh-STAT 5(E)敲除STAT 5來(lái)處理細(xì)胞，CD71 、P-STAT 5與STAT 5蛋白的表達(dá)水平。F、Western blot和RT-PCR檢測(cè)CD71 、P-STAT 5與STAT 5蛋白和LncRNA-IUR-5的表達(dá)水平。G、從穩(wěn)定表達(dá)LncRNA-IUR -S1、Iur-5或Iur-5的K 562細(xì)胞株中提取與LncRNA-IUR-5結(jié)合的蛋白。H、通過(guò)RIP驗(yàn)證LncRNA-IUR-5與STAT5的相互作用。lncRNA-BGL3和gapdh2為陰性對(duì)照。I和J、qPCR檢測(cè)在STAT5-IN-1處理后或敲減K562細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-IUR的表達(dá)。