Zfp217介導(dǎo)m6A mRNA甲基化協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控促進(jìn)脂肪形成分化

關(guān)于m6A RNA甲基化的研究，已經(jīng)成為當(dāng)下火熱的研究領(lǐng)域。m6A修飾酶出現(xiàn)異常表達(dá)將會引起一系列疾病，包括腫瘤、神經(jīng)性疾病、胚胎發(fā)育遲緩等。近期Nucleic Acids Research上發(fā)表了一篇題名為：Zfp217介導(dǎo)m 6 A mRNA甲基化協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控促進(jìn)脂肪形成分化。文章發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白（Zfp217）將基因轉(zhuǎn)錄與m6A mRNA甲基化修飾結(jié)合，以促進(jìn)脂肪形成。 Zfp217通過激活m6A去甲基酶FTO的轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)m6A mRNA甲基化。并且Zfp217的降低損害了3T3L1細(xì)胞的脂肪形成分化并導(dǎo)致m6A甲基化修飾的整體增加。此外，Zfp217與YTHDF2的相互作用對于FTO維持其與各種mRNA上的m6A位點的相互作用是至關(guān)重要的，因為Zfp217的缺失導(dǎo)致FTO降低并增加m6A水平。

技術(shù)路線：

1.Zfp217的缺失會阻礙脂肪分化
首先使用siRNA減少Zfp217 mRNA和蛋白的表達(dá)， Zfp217敲低顯著阻斷脂肪形成，表現(xiàn)為油紅O染色水平降低以及關(guān)鍵脂肪形成基因PPARγ，aP2，LPL和脂聯(lián)素的低表達(dá)。使用CRISPR / Cas9技術(shù)完全刪除Zfp217基因，消除了3T3L1細(xì)胞中的脂肪形成。還使用來自Zfp217單倍體不足的小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞（MEF- Zfp217+/?）檢查了Zfp217減少對脂肪形成的影響。

2.Zfp217抑制增強脂肪生成過程中的m6A修飾
為了鑒定Zfp217在3T3L1細(xì)胞中的功能，通過斑點印跡和LC-MS / MS定量檢測mRNA中的m6A修飾。與對照組相比，使用siRNA和CRISPR / Cas9的細(xì)胞顯示，Zfp217表達(dá)降低細(xì)胞中m6A甲基化水平全面增加.m6A免疫染色還揭示了在Zfp217敲低細(xì)胞中更高水平的m6A修飾。此外，為了確定Zfp217在脂肪生成過程中調(diào)節(jié)m6A修飾中的作用，在2天MDI誘導(dǎo)后通過斑點印跡檢測m6A水平。對照組和Zfp217缺失細(xì)胞之間存在差異，這可能意味著Zfp217-m6A途徑在脂肪形成中的早期功能。與野生型相比，MEF-Zfp217 +/-中的m6A修飾也顯著增加。總之，這些結(jié)果表明Zfp217對于細(xì)胞m6A RNA甲基化是重要的。

3.Zfp217直接激活FTO的轉(zhuǎn)錄
Zfp217是如何抑制m6A mRNA甲基化？為了闡明Zfp217在調(diào)節(jié)m6A修飾中的作用，檢測了m6A甲基化中涉及的關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。Zfp217的敲低顯著增加了METTL3的蛋白質(zhì)表達(dá)并降低了FTO的表達(dá)。表明FTO和METTL3都可能在Zfp217相關(guān)的m6A修飾中起作用。隨后，F(xiàn)TO的mRNA水平通過Zfp217在3T3L1細(xì)胞中的過表達(dá)或敲低調(diào)節(jié)，而METTL3水平未改變。此后，參考驗證Zfp217是否可以調(diào)節(jié)FTO作為轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。利用生物信息學(xué)方法我們推斷FTO是Zfp217的靶基因。接下來，使用雙熒光素酶顯示系統(tǒng)來驗證Zfp217增強FTO的啟動子活性，而FTO啟動子中Zfp217結(jié)合序列的缺失抑制它，表明Zfp217在FTO上的直接調(diào)節(jié)。因此，Zfp217在FTO啟動子區(qū)的定位也通過使用Zfp217特異性抗體的ChIP-QPCR測定來確認(rèn)。通過基因序列分析，準(zhǔn)確的結(jié)合DNA序列與FTO的基因組序列完全一致。與這些觀察結(jié)果一致，發(fā)現(xiàn)FTO通過Zfp217缺失來挽救脂肪生成的抑制，并且一致地增加PPARγ，aP2，LPL和Adiponection的基因表達(dá)。m6A可能是Zfp217-FTO依賴性調(diào)節(jié)脂肪形成方式的主要靶點。這些數(shù)據(jù)證明了Zfp217作為轉(zhuǎn)錄因子，與FTO基因的啟動子結(jié)合以增強脂肪生成，這可能是在脂肪生成過程中一種調(diào)節(jié)m6A修飾的方式。

4.Zfp217正向調(diào)節(jié)參與脂肪生成的上皮轉(zhuǎn)錄組
為了描述Zfp217在脂肪生成中作用，在對照和Zfp217敲除3T3L1細(xì)胞中進(jìn)行RNA測序，MDI處理0和2天，并鑒定了12 188和11 566個差異表達(dá)基因，分別為0和2天。與野生型相比， Zfp217缺失細(xì)胞中絕大多數(shù)（1431）基因上調(diào)，MDI處理0 d組與2d顯著重疊，同時也鑒定了941個下調(diào)基因。通過GO分析，發(fā)現(xiàn)下調(diào)的基因主要與細(xì)胞周期，RNA加工和脂質(zhì)生物合成進(jìn)展有關(guān)，表明Zfp217參與RNA加工和脂質(zhì)代謝的適當(dāng)調(diào)節(jié)。為了闡明Zfp217調(diào)節(jié)m6A修飾的機制，采用MeRIP-seq測序分析MDI處理0和2天對照組和Zfp217敲除3T3L1細(xì)胞中m6A mRNA甲基化情況。發(fā)現(xiàn)GGACU高度富集的并且始終表示為最佳序列基序。接下來試圖研究關(guān)鍵的m6A位點是否受Zfp217缺失的影響。結(jié)果表明，5'UTR和3'UTR中m6A位點的相對密度高于其他區(qū)域。而且Zfp217缺失增加了MDI0 d的m6A富集0 d，而不是2 d，這意味著這些轉(zhuǎn)錄本具有Zfp217敲除依賴性方式。

選擇了一些其他關(guān)鍵目標(biāo)用于進(jìn)一步實驗，來自UP組的Ccdc141，來自DOWN組的Efcab11，來自參考文獻(xiàn)的Hspa1a，觀察到RNA-seq數(shù)據(jù)的顯著變化。接下來，為了驗證RNA-seq和MeRIP-seq的結(jié)果，選擇這些基因用于QPCR和MeRIP-QPCR分析。他們用RNA-seq顯示相似的基因表達(dá)譜，并且MeRIP-QPCR顯示在Zfp217缺失后這些轉(zhuǎn)錄物上的m6A修飾增加。此外，為了驗證這些靶基因的作用，siRNA對Ccdc141，Hspa1a和Efcab11的功能喪失影響表現(xiàn)出脂肪生成水平的降低?？傊?，我們的數(shù)據(jù)揭示了這種正相關(guān)關(guān)系。在脂肪形成過程中Zfp217敲除后mRNA表達(dá)與m6A mRNA甲基化之間的關(guān)系。

5.Zfp217與YTHDF2相互作用以維持FTO的m6A去甲基化活性
為了進(jìn)一步探索Zfp217促進(jìn)脂肪生成的分子機制，進(jìn)行了免疫沉淀實驗,通過Co-IP驗證了Zfp217和YTHDF2之間的特異性相互作用，以及3T3L1（有無MDI處理）和HEK293T細(xì)胞中內(nèi)源蛋白和Flag標(biāo)記蛋白的反向Co-IP實驗。因此，這兩種蛋白質(zhì)都是分布在3T3L1和HEK293T全細(xì)胞中，Zfp217在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)多于細(xì)胞核。共聚焦顯微鏡檢查，以監(jiān)測內(nèi)源性Zfp217和YTHDF2的細(xì)胞定位。有趣的是，使用共聚焦Z分析在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中觀察到Y(jié)THDF2和Zfp217的共定位，這可能表明YTHDF2在Zfp217依賴性脂肪細(xì)胞生成中的特定功能。

我們進(jìn)一步全面分析了YTHDF2和Zfp217與FTO相互作用的生物學(xué)功能。正如預(yù)期，F(xiàn)TO和Zfp217的過表達(dá)顯示較低的m6A水平，YTHDF2阻斷FTO的去甲基化酶活性以增加m6A水平，而Zfp217作為調(diào)節(jié)劑使平衡傾向于去甲基化。體外m6A RNA pull-down試驗證實了FTO和YTHDF2之間的直接競爭，靶向Hspa1a的m6A ssRNA。顯然，Zfp217不與RNA結(jié)合，而是干擾YTHDF2位置并拯救FTO以結(jié)合RNA。結(jié)合體外RNA下拉和斑點印跡測定以評估FTO的m6A去甲基化活性，還證實Zfp217螯合YTHDF2以維持FTO的m6A去甲基化活性。為了確定Zfp217是否在體外與YTHDF2直接相互作用，我們進(jìn)行了LSPR。結(jié)果清楚地表明Zfp217以劑量依賴性方式直接與YTHDF2相互作用。結(jié)合YTHDF2后，Zfp217組織含m6A的ssRNA與YTHDF2結(jié)合。

6.YTHDF2的敲低挽救了對Zfp217消耗介導(dǎo)的脂肪生成的抑制
為了進(jìn)一步研究Zfp217如何通過m6A修飾調(diào)節(jié)靶基因的潛在分子機制，關(guān)注YTHDF2并驗證其在Zfp217介導(dǎo)的脂肪生成中的作用。YTHDF2的敲低挽救了Zfp217缺陷細(xì)胞中的脂肪形成，而YTHDF2敲低后基因的m6A修飾較低，表明YTHDF2在Zfp217介導(dǎo)的脂肪生成起關(guān)鍵作用。

總之，這些結(jié)果確定Zfp217以YTHDF2依賴性方式平衡關(guān)鍵基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致脂肪生成的促進(jìn)。提出了一種Zfp217調(diào)節(jié)脂肪生成的方式。