m6A又一高分文章新鮮出爐啦

近年來，關(guān)于m6A的研究也已逐漸成為一個熱門項目。MiR-221/miR-222在多種癌癥研究中均有著不同程度的影響。今年6月，Han J等人在雜志《molecular cancer》上發(fā)表了一篇題為“METTL3 promote tumor proliferation of bladder cancer by accelerating pri-miR221/222 maturation in m6A-dependent manner”的高分文章（IF=10.679），結(jié)合兩大熱門研究來探討膀胱癌的發(fā)展，首次通過調(diào)節(jié)非編碼核糖核酸的m6A修飾來影響腫瘤形成的綜合，發(fā)現(xiàn)METTL3與膀胱癌患者預(yù)后不良有關(guān)，可以作為膀胱癌的新型預(yù)后和治療靶點，為膀胱癌治療提供新的見解。
 

膀胱癌（BCA）已成為美國第五大常見癌癥，2018年估計有81,190例新病例。膀胱癌的發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，由異常的遺傳變化和表觀遺傳異常引起。表觀遺傳異常主要發(fā)生在DNA，RNA和組蛋白修飾的許多層面。在RNA水平中，m6A是最常見的甲基化修飾之一。我們都知道METTL3參與RNA生命周期的所有階段。它通過調(diào)控關(guān)鍵癌基因或腫瘤抑制因子mRNAs中的m6A修飾來影響腫瘤的形成。在膀胱癌中，METTL3可通過AFF4/NF-κB/MYC信號網(wǎng)絡(luò)以m6A依賴方式促進膀胱癌的進展。最近，還發(fā)現(xiàn)METTL3影響non-coding RNAs (包括miRNAs, lincRNAs和circRNAs)中的m6A修飾。然而，這一機制是否與METTL3誘導(dǎo)的腫瘤增殖有關(guān)尚未報道。
研究思路：

結(jié)果分析
一、METTL3在膀胱癌和膀胱癌中上調(diào)與膀胱癌患者的預(yù)后相關(guān)
與鄰近組織相比，METTL3在膀胱癌組織中顯著上調(diào)（圖1a），結(jié)果與TCGA數(shù)據(jù)庫（https://cancergenome.nih.gov）下載的具有詳細(xì)臨床信息的腫瘤樣本的結(jié)果一致。METTL3的蛋白質(zhì)水平與鄰近的正常組織相比，膀胱癌組織也顯著增加（圖1b）。研究者發(fā)現(xiàn)METTL3在膀胱癌細(xì)胞系中上調(diào)，與正常細(xì)胞系SV-HUC相比，mRNA和蛋白水平都有上調(diào)（圖1c，d）。膀胱癌組織中的IHC分析顯示METTL3的表達(dá)與腫瘤組織學(xué)分級有關(guān)（表1）。組織學(xué)分級較高METTL3組的高表達(dá)。此外，Kaplan-Meier存活曲線分析顯示，METTL3高表達(dá)的膀胱癌患者預(yù)后較差，生存時間較短，而METTL3表達(dá)較低（圖1f）。

二、在體內(nèi)和體外試驗中，METTL3的敲減抑制了膀胱癌的增殖
兩種膀胱癌細(xì)胞系T24和EJ用敲低慢病毒和對照慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。然后用qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡確認(rèn)METTL3的表達(dá)。CCK8測定顯示METTL3敲低導(dǎo)致細(xì)胞增殖顯著減少（圖2a，b）。菌落形成試驗也表明了這一點敲低METTL3降低了集落形成效率（圖2c，d）。此外，流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，METTL3敲低細(xì)胞中G1的百分比增加，S期的百分比降低（圖2e，f）。在異種移植模型中，注射METTL3（shMETTL3）細(xì)胞的腫瘤比注射對照細(xì)胞（shNC）的腫瘤生長更慢（圖2g，h）。

三、在體內(nèi)和體外試驗中，METTL3的過度表達(dá)促進了膀胱癌的增殖
  CCK8測定表明METTL3的過表達(dá)顯著促進細(xì)胞生長與oeNC組（圖3a，b）。殖民地形成測定還顯示，在METTL3過表達(dá)細(xì)胞中集落形成效率增加（圖3c，d）。此外，流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，METTL3過表達(dá)細(xì)胞中G1期百分比降低，S期百分比增加（圖3e，f）。此外，注射METTL3過表達(dá)（oeMETTL3）細(xì)胞的腫瘤比在皮下異種移植腫瘤模型中注射對照細(xì)胞（oeNC）的腫瘤生長更快（圖3g，h）。

四、METTL3與DGCR8蛋白互作，以m6A依賴性方式調(diào)節(jié)pri-miR221/222
m6A印跡顯示METTL3敲低顯著降低了m6A水平。相反，在T24和EJ細(xì)胞系中，METTL3過表達(dá)增加了m6A水平（圖4a）。免疫沉淀實驗表明METTL3可與DGCR8結(jié)合，RNase處理減弱了METTL3和DGCR8的結(jié)合，表明它們的結(jié)合可能部分由miRNA介導(dǎo)（圖4b）。我們還觀察到METTL3過表達(dá)細(xì)胞中DGCR8結(jié)合的miRNA顯著增加（圖4c），證實METTL3可能影響DGCR8與m6A甲基化miRNA的結(jié)合。所有這些結(jié)果都暗示著METTL3可通過調(diào)節(jié)DGCR8的識別和結(jié)合來影響pri-miRNA的加工膀胱癌中的pri-miRNA。
研究發(fā)現(xiàn)只有miR221/222，miR225，miR4485和let-7e在METTL3敲低后在T24中被改變。經(jīng)研究預(yù)測在膀胱癌中的預(yù)后數(shù)據(jù)庫（http://kmplot.com/analysis/）只有miR221/222在膀胱癌中發(fā)揮了致癌作用。然后通過調(diào)節(jié)miRNA221/222在膀胱癌中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR221/222在METTL3敲低細(xì)胞中顯著下降并在METTL3過表達(dá)細(xì)胞中上調(diào)（圖4d），pri-miR221/222的累積發(fā)生在METTL3敲低細(xì)胞中并且在METTL3過表達(dá)細(xì)胞中降低（圖4e）。相關(guān)性分析顯示56個腫瘤組織中METTL3和miR221（r = 0.2928，P <0.01）或miR222（r = 0.2386，P <0.01）的表達(dá)呈正相關(guān)（圖4f）。此外，研究者發(fā)現(xiàn)通過從METTL3過表達(dá)細(xì)胞免疫沉淀的DGCR8增加了pri-miR221/222結(jié)合水平（圖4g）。此外，MeRIP顯示METTL3過表達(dá)顯著增加m6A修飾的pri-miR221/222的量（圖4h）?？傊?，這些結(jié)果表明METTL3可以增強DGCR8對pri-miR221/222的識別以及隨后以m6A方式處理成熟miRNA。

五、miR221/222干擾挽救了擴散METTL3誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡
當(dāng)我們在METTL3敲低細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR221/222 mimics時，研究者發(fā)現(xiàn)miR221/222 mimics可部分增加由METTL3敲低抑制的膀胱癌細(xì)胞增殖（圖5a）。因此，miR221/222抑制劑可部分降低METTL3過表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖（圖5b）。集落形成實驗也表明miR221/222 mimics可部分增加膀胱癌細(xì)胞。通過敲低METTL3抑制集落形成效率（圖5c，d）。

六、miR221/222靶向PTEN治療膀胱癌
通過mirtarbase數(shù)據(jù)庫（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw）發(fā)現(xiàn)在PTEN mRNA的3'-UTR中存在miR221/222的結(jié)合位點。（圖6a）。此外，進行雙熒光素酶報告基因測定克隆野生型3'-UTR序列和PTEN的突變體3'-UTR序列以構(gòu)建報告質(zhì)粒和突變載體，發(fā)現(xiàn)miR221/222mimics和野生型報告基因質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染顯著降低了熒光素酶活性。相反，miR221/222共轉(zhuǎn)染的mimics和突變質(zhì)粒之間的熒光素酶活性沒有顯著差異（圖6b）。通過qRT-PCR和蛋白質(zhì)印跡驗證了PTEN在METTL3敲低或過表達(dá)膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示METTL3敲低細(xì)胞中PTEN的表達(dá)顯著增加，METTL3過表達(dá)中PTEN的表達(dá)降低（圖6c，d）。此外，PTEN的表達(dá)miR221/222 mimics轉(zhuǎn)染后減少（圖6e）并且在miR221/222抑制劑轉(zhuǎn)染后增加進入膀胱癌細(xì)胞（圖6f）。
通過突變PTEN的3'-UTR區(qū)的結(jié)合位點進行熒光素酶報告基因測定和m6A RNA免疫沉淀測定，結(jié)果顯示在膀胱癌細(xì)胞中野生型和突變質(zhì)粒之間的熒光素酶活性沒有顯著差異。 MeRIP結(jié)果還顯示m6A和IgG沉淀的PTEN沒有顯著差異?？傊@些結(jié)果表明METTL3可能不直接調(diào)節(jié)膀胱癌中的PTEN mRNA。

七、PTEN與膀胱癌組織中的METTL3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)
通過qRT-PCR研究了患者組織中METTL3和PTEN的表達(dá)。結(jié)果顯示PTEN表達(dá)與METTL3在膀胱癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（圖7a）。此外，注射METTL3（shMETTL3）的腫瘤中PTEN的mRNA水平顯著高于注射對照（shNC）的腫瘤（圖7b），而注射METTL3過表達(dá)細(xì)胞的腫瘤中PTEN的mRNA水平（oeMETTL3）顯著低于注射對照細(xì)胞（oeNC）的那些（圖7c）。在異種移植模型中觀察到PTEN蛋白水平的相同變化（圖7d，e）。皮下異種移植腫瘤的IHC顯示MET17陽性率顯著降低，并且METTL3敲低組中PTEN陽性率顯著增加（圖7f）。 METTL3過表達(dá)組具有相反的結(jié)果（圖7g）?？傊芯空甙l(fā)現(xiàn)PTEN與膀胱癌組織中的METTL3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

結(jié)論:
METTL3可能通過與微處理器蛋白DGCR8相互作用并以m6A依賴的方式積極調(diào)節(jié)pri-miR221/222過程，在膀胱癌中可能具有致癌作用。據(jù)我們所知，這是第一個通過調(diào)節(jié)非編碼核糖核酸的m6A修飾來影響腫瘤形成的綜合研究，這可能為膀胱癌治療提供新的見解。