科研者必帶武器-pull down 技術(shù)
作為生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，蛋白質(zhì)參與各類(lèi)生命現(xiàn)象，大部分蛋白質(zhì)在行使功能的時(shí)候并不是單打獨(dú)斗的，蛋白質(zhì)們相互聯(lián)系一起工作，彼此形成了復(fù)雜的生化網(wǎng)絡(luò)。因此，研究蛋白質(zhì)的相互作用成為研究蛋白質(zhì)功能和作用機(jī)制的最為重要的環(huán)節(jié)之一。蛋白-蛋白互作的各類(lèi)研究技術(shù)方法層出不窮。這里，小編來(lái)淺談下蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)中一種比較經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)技術(shù)- pull down 實(shí)驗(yàn)。
pull down 實(shí)驗(yàn)又叫做蛋白質(zhì)體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)（binding assay in vitro），是一個(gè)行之有效的驗(yàn)證酵母雙雜交系統(tǒng)的體外試驗(yàn)技術(shù)。用固相化的、已標(biāo)記的餌蛋白或標(biāo)簽蛋白(生物素-、PolyHis-或GST-)，從細(xì)胞裂解液中釣出與之相互作用的蛋白。帶標(biāo)簽的誘餌蛋白能被特異結(jié)合該標(biāo)簽的固相親和配基捕獲，形成次級(jí)親和支持物”，用于純化與誘餌蛋白相互作用的其他蛋白。純化產(chǎn)物洗脫后，經(jīng)Western blot驗(yàn)證或LC-MS/MS，即可證明或鑒定與誘餌蛋白互作的蛋白。
這里，小編重點(diǎn)介紹下應(yīng)用最廣泛的GST - pull down。其利用了GST（Glutathione S transferase）對(duì)GTH（Glutathione）的親和性，將靶蛋白-GST融合蛋白親和固化在GTH親和樹(shù)脂上，作為與目的蛋白親和的支撐物，充當(dāng)一種“誘餌蛋白”，當(dāng)?shù)鞍兹芤和ㄟ^(guò)層析柱或與此固相復(fù)合物混合時(shí)，可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”，洗脫結(jié)合物后可通過(guò)SDS-PAGE電泳分析，從而證實(shí)兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白。“誘餌蛋白”一般采用原核表達(dá)獲得，“捕獲蛋白”可通過(guò)細(xì)胞裂解物、純化的蛋白、表達(dá)系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得。
實(shí)驗(yàn)流程：
應(yīng)用：通過(guò)GST融合蛋白pull-down技術(shù)一是鑒定能與已知融合蛋白相互作用的未知蛋白質(zhì)；二是鑒定兩個(gè)已知蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。
高準(zhǔn)確性，高靈敏度。適合中度復(fù)雜的蛋白質(zhì)樣品，如相互作用的蛋白質(zhì)條帶和洗脫液；
Tips：
1.若要驗(yàn)證某蛋白X與誘餌蛋白的相互作用，可將蛋白復(fù)合物與X蛋白的抗體孵育，做Western blot驗(yàn)證即可；如要尋找誘餌蛋白可能的互作蛋白，則需將蛋白復(fù)合物做LC-MS/MS鑒定。
2.高純度的GST融合蛋白能夠減少實(shí)驗(yàn)的假陽(yáng)性。為了能夠最大程度的保證融合蛋白原有的生物學(xué)活性，一般在獲取融合蛋白時(shí)傾向于獲取可溶性融合蛋白。（獲得條件主要有：載體的選擇、可溶性蛋白表達(dá)條件的選擇、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)物的濃度）
3.內(nèi)源性蛋白的干擾使得實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)的假陽(yáng)性結(jié)果較多。關(guān)于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，需要嚴(yán)謹(jǐn)，對(duì)照的設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性，bait-prey 的互換等等都需要在做實(shí)驗(yàn)之前認(rèn)真探討和考慮。
4. 實(shí)驗(yàn)一般用于體外轉(zhuǎn)錄或翻譯體系，如酵母雙雜交系統(tǒng)中檢測(cè)蛋白質(zhì)之間的相互作用。但并不一定能真實(shí)的反應(yīng)蛋白質(zhì)之間的相互作用，因?yàn)樵隗w內(nèi)它們不一定空間上有碰到，所以并不意味著在生理?xiàng)l件下一定結(jié)合。
Pull down技術(shù)研究蛋白互作的方法不僅強(qiáng)大，而且高效快速，操作簡(jiǎn)便，可直接檢測(cè)是否具有相互作用。這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)有利有弊，但不可否認(rèn)的是，它一定是科研者必帶武器，權(quán)衡使用一定能幫助大家的科研之路越來(lái)越順利。